基于桂花全基因组开发的SSR分子标记引物组及其应用

本发明属于分子生物学，具体涉及一种基于桂花全基因组开发的ssr分子标记引物组及其应用。

背景技术：

1、桂花(osmanthus fragrans)，隶属于木犀科木犀属，是我国十大传统名花之一，在南岭以北至秦岭淮河流域以南的广大地区均有栽培，至今已有近2500年的栽培历史。在常年的栽培驯化过程中，桂花形成了银桂、金桂、丹桂以及四季桂四类在花色和花期方面具有明显分化的品种群。然而，由于桂花花小，花期集中且花期短，从传统形态学层面对桂花品种进行快速和准确的鉴定具有一定的困难，由此造成了各地桂花品种分类标准不一，栽培混乱的现象，并严重制约着桂花产业的高质量发展。因此，亟需开发出更加快速、准确的检测方法，为桂花品种鉴定和种质资源的开发利用提供依据。

2、简单重复序列(ssr)，又称短串联重复(str)，微卫星，是以1-6个碱基为重复单元组成的短串联重复dna序列。ssr标记是理想的共显性分子标记，在基因组中广泛存在，具有多态性高、重复性好、成本低、易操作等优点，被广泛应用于园艺植物种质资源的品种鉴定以及遗传多样性的研究中。同样，ssr标记也是桂花种质资源鉴定和遗传多样性研究的一种重要工具。然而，目前已开发出的针对桂花的ssr引物仍相对较少，且效率低，极大限制了ssr标记在桂花研究中的应用，更无法满足生产与科研的需求。

技术实现思路

1、为了解决现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种能够适用于桂花的具有通用性和高效性的ssr分子标记引物组及其应用。本发明所述ssr分子标记引物组基于桂花全基因组层面筛选获得，同时建立相应的ssr扩增技术体系应用于种质资源鉴定、桂花遗传多样性分析、新品种保护和/或指纹图谱构建等领域。

2、本发明所采用的技术方案为：

3、一种基于桂花全基因组开发的ssr分子标记引物组，包括以下4对引物序列：

4、p2-90：f：5’-gatccctgtcgcctgaatga-3’，

5、r：5’-caccccacgccacatataca-3’；

6、p3-120：f：5‘-ctcctgacgcttggaggaaa-3’，

7、r：5’-tggtgatggtcaattcagcct-3’；

8、p2-60：f：5’-tggcttccatgaaaactagacgt-3’，

9、r：5’-tcacttgacccacatcggtg-3'

10、p2-98：f：5’-ctggaaaccaccgcgatagt-3’，

11、r：5’-actacagcactgacgctcac-3’。

12、所述的基于桂花全基因组开发的ssr分子标记引物组在桂花种质资源鉴定、遗传结构及遗传多样性分析、新品种保护和/或指纹图谱构建中的应用。

13、所述的应用包括如下步骤：

14、(1)提取桂花的基因组dna；

15、(2)以步骤(1)提取的基因组dna为模板，利用权利要求1所述ssr分子标记引物组中的每个引物对分别进行pcr扩增；

16、(3)对步骤(2)扩增的pcr产物进行分型；

17、(4)对步骤(3)获得的分型结果进行数据分析，以实现种质资源鉴定、遗传结构及遗传多样性分析、新品种保护和/或指纹图谱构建。

18、步骤(2)中，所述pcr扩增的反应体系为：30ng/μl的模板dna 0.2μl，10pm/μl正向引物0.06μl，10pm/μl反向引物0.3μl，25pm/μl带有fam荧光标记的m13通用引物0.12μl，2×taqpcr mastermix7.5μl，加双蒸水至15μl。

19、所述pcr扩增的反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，各引物对退火温度下退火45s，72℃延伸45s，30个循环；94℃变性30s，53℃复性45s，72℃延伸45s，8个循环，72℃延伸10min后于4℃终止反应。

20、步骤(3)中，利用毛细管电泳对扩增的pcr产物进行分型。

21、步骤(4)中，采用生物信息学软件对步骤(3)获得的分型结果进行数据分析。

22、本发明的有益效果为：

23、本发明基于桂花全基因组开发的ssr分子标记引物组，具有很好的通用性，稳定高效，可从分子水平快速鉴别桂花种质资源，不受季节、植物发育时期和生长环境的影响，利用ssr分子标记引物组开展桂花的品种鉴定技术具有取材方便、结果高度准确稳定的特点，为桂花种质资源的快速鉴定、新品种保护、遗传多样性评价和分子标记辅助育种等研究提供了参考和依据。

技术特征：

1.一种基于桂花全基因组开发的ssr分子标记引物组，其特征在于，包括以下4对引物序列：

2.根据权利要求1所述的基于桂花全基因组开发的ssr分子标记引物组在桂花种质资源鉴定、遗传结构及遗传多样性分析、新品种保护和/或指纹图谱构建中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(2)中，所述pcr扩增的反应体系为：30ng/μl的模板dna 0.2μl，10pm/μl正向引物0.06μl，10pm/μl反向引物0.3μl，25pm/μl带有fam荧光标记的m13通用引物0.12μl，2×taq pcr mastermix7.5μl，加双蒸水至15μl。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述pcr扩增的反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，各引物对退火温度下退火45s，72℃延伸45s，30个循环；94℃变性30s，53℃复性45s，72℃延伸45s，8个循环，72℃延伸10min后于4℃终止反应。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(3)中，利用毛细管电泳对扩增的pcr产物进行分型。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(4)中，采用生物信息学软件对步骤(3)获得的分型结果进行数据分析。

技术总结
本发明公开了一种基于桂花全基因组开发的SSR分子标记引物组及其应用，本发明所述SSR分子标记引物组具有很好的通用性，稳定高效，可从分子水平快速鉴别桂花种质资源，不受季节、植物发育时期和生长环境的影响，利用本发明所述SSR分子标记引物组开展桂花的品种鉴定技术具有取材方便、结果高度准确稳定的特点，为桂花种质资源的快速鉴定、新品种保护、遗传多样性评价和分子标记辅助育种等研究提供了参考和依据。

技术研发人员：张敏,朱跃,段一凡,王贤荣,张成,陈林,朱福远
受保护的技术使用者：南京林业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12