一种质控品DNA序列及其应用的制作方法

本发明属于病毒检测，特别涉及一种质控品dna序列及其应用。

背景技术：

1、患者感染初期的症状主要以发热、干咳、乏力为主，严重者可快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍，少数感染者感染后，仅表现为低热、轻微乏力等，无肺炎表现。最常用的covid-19病毒快速检测技术主要为逆转录定量pcr法（qrt-pcr），在qpcr检测过程中常常会出现假阳性，主要是因为质控品的污染。qpcr假阳性会给sars-cov-2的检测带来很大的麻烦，导致检测出现错误。

技术实现思路

1、为了解决qpcr检测过程中的假阳性问题，本发明提供了一种质控品dna序列及其应用，方案如下：

2、一方面，本发明实施例提供了一种质控品dna序列，包括载体dna序列、m个拷贝的待测a基因靶标对应的dna序列和k个拷贝的待测b基因靶标对应的dna序列等，待测a基因靶标和待测b基因靶标均为待测病毒的特有基因序列且其在待测病毒中的数量分别为x和y，x/y≠m/k。因x/y≠m/k，而靶标扩增效率相同，固在检测结果上会体现出两种靶标的detailct值的差异，从而区分该阳性是由质控品污染还是真病毒样本。

3、其中，载体dna序列可以为常见的载体，选自质粒载体，噬菌体载体、柯斯质粒载体、m13噬菌体载体或噬菌粒载体等；如为puc57质粒载体。载体dna序列要求与待测病毒和检测探针不相似，不能影响检测。

4、优选地，m*y/x*k≥2，以更轻松地划定阈值。

5、具体地，待测病毒为sars-cov-2时，所用试剂盒n基因靶标序列和orf1ab基因靶标扩增效率相差不大，sars-cov-2病毒中，x/y≤1；待测a基因靶标为orf1ab基因的seq idno:2序列，m为2；待测b基因靶标为n基因，k为1。

6、进一步地，m个拷贝的待测a基因靶标对应的dna序列和k个拷贝的待测b基因靶标对应的dna序列按一定顺序连接在一起后再与载体连接。优选地，待测a基因靶标对应的dna序列和待测b基因靶标对应的dna序列尽量避免单个基因重复连接以降低合成难度。

7、进一步地，待测病毒为sars-cov-2时，该质控品dna序列转录为rna序列使用。

8、更具体地，待测病毒为sars-cov-2时，该质控品dna序列包括载体（具体为puc57质粒载体）、2个拷贝的orf1ab基因对应的dna序列（可参见seq id no:2）和1个拷贝的n基因对应的dna序列（可参见seq id no:1），2个orf1ab基因对应的dna序列分别位于n基因对应的dna序列的两端。

9、另一方面，本发明实施例还提供了前述质控品dna序列的制备方法，包括以下步骤：

10、s1：对待测样本基因组序列进行分析，得到a基因靶标序列对应的dna序列和b基因靶标序列对应的dna序列，通过化学合成得到a基因的m个拷贝的靶标序列和b基因的k个拷贝的靶标序列的dna片段。

11、s2：将步骤s1中得到的dna片段克隆至puc57质粒载体上。挑选阳性克隆进行扩大培养，提取质粒得到阳性对照质粒。

12、又一方面，本发明实施例还提供了前述质控品dna序列及其转录的rna序列在区分qpcr假阳性中的应用。

13、其中，通过待测a基因靶标和待测b基因靶标的detail ct值的差值来判断假阳性。采用不同的基因靶标，detail ct值的差值不同，可采用大量实验并结合统计学来得到差值的阈值。

14、具体地，质控品dna序列对应的rna序列在sars-cov-2检测时区分qpcr假阳性中的应用。

15、其中，在sars-cov-2检测时。所用试剂盒n基因靶标序列和orf1ab基因靶标扩增效率相差不大，待测a基因靶标为orf1ab基因的seq id no:2序列，m为2；待测b基因靶标为n基因，k为1；若待测a基因靶标的detail ct值与待测b基因靶标的detail ct值的差值（阈值为0）小于0，则为阳性质控污染；反之，则为真阳性。在sars-cov-2检测时，如果采用n基因和orf1ab基因的seq id no:2序列作为靶标，假阳性判断时，刚好以0作为判断的阈值，非常方便。

16、在本专利中，根据两种靶标的detail ct值的差异，从而区分该阳性是由质控品污染还是真病毒样本。尤其是，在sars-cov-2检测时，直接判断待测a基因靶标的detail ct值与待测b基因靶标的detail ct值的差值是否小于0即可判断。

技术特征：

1.一种质控品dna序列，其特征在于，包括载体dna序列、m个拷贝的待测a基因靶标对应的dna序列和k个拷贝的待测b基因靶标对应的dna序列，所述待测a基因靶标和待测b基因靶标均为待测病毒的特有基因序列且其在待测病毒中的数量分别为x和y，所述x/y≠m/k。

2.根据权利要求1所述的质控品dna序列，其特征在于，所述载体选自质粒载体，噬菌体载体、柯斯质粒载体、m13噬菌体载体或噬菌粒载体。

3.根据权利要求1所述的质控品dna序列，其特征在于，m*y/x*k≥2。

4.根据权利要求1所述的质控品dna序列，其特征在于，待测病毒为sars-cov-2时，所述待测a基因靶标为orf1ab基因，所述m为2；所述待测b基因靶标为n基因，所述k为1。

5.根据权利要求4所述的质控品dna序列，其特征在于，待测病毒为sars-cov-2时，该质控品dna序列包括载体、2个拷贝的orf1ab基因对应的dna序列和1个拷贝的n基因对应的dna序列，2个orf1ab基因对应的dna序列分别位于n基因对应的dna序列的两端。

6.权利要求1-5任一项所述的质控品dna序列及其转录的rna序列在区分qpcr假阳性中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，通过待测a基因靶标和待测b基因靶标的detail ct值的差值来判断假阳性。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述质控品dna序列对应的rna序列在sars-cov-2检测时区分qpcr假阳性中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，在sars-cov-2检测时，待测a基因靶标为orf1ab基因，m为2；待测b基因靶标为n基因，k为1；若待测a基因靶标的detail ct值与待测b基因靶标的detail ct值的差值小于0，则为阳性质控污染；反之，则为真阳性。

技术总结
本发明公开了一种质控品DNA序列及其应用，属于病毒检测技术领域。包括载体DNA序列、M个拷贝的待测A基因靶标对应的DNA序列和K个拷贝的待测B基因靶标对应的DNA序列，所述待测A基因靶标和待测B基因靶标均为待测病毒的特有基因序列且其在待测病毒中的数量分别为X和Y，X/Y≠M/K。在SARS‑CoV‑2检测时，待测A基因靶标为orf1ab基因，M为2；待测B基因靶标为N基因，K为1；若待测A基因靶标的detail Ct值与待测B基因靶标的detail Ct值的差值小于阈值，则判断为阳性质控污染；反之，则为真阳性。根据两种靶标的detail ct值的差异，从而区分该阳性是由质控品污染还是真病毒样本。

技术研发人员：曾丰波,钟京,杨功达
受保护的技术使用者：武汉蓝沙医学检验实验室有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13