一种根癌农杆菌介导的萝卜遗传转化方法及其应用

本发明属于蔬菜遗传育种与生物。本发明通过选择合适基因型，侵染萝卜带柄子叶，解决了传统浸花法转化中存在的筛选效率低以及耗时费力问题，操作简便高效，能够快速获得目的基因稳定遗传的萝卜转基因植株。

背景技术：

1、萝卜(raphanus sativus l.)是原产于我国的十字花科萝卜属一、二年生根菜类蔬菜作物。食用部位主要为膨大的肉质根，营养丰富，用途多样，在我国蔬菜种植面积中排名前列，在蔬菜生产与供应中占有重要地位。

2、植物高频离体再生体系的建立是进行园艺性状基因功能验证的先决条件。然而，萝卜是一种再生顽拗型蔬菜作物，虽然已有浸花法转化萝卜的报道，但获得阳性转基因苗的频率很低。尽管有利用萝卜下胚轴作为外植体的遗传转化方法，但其受基因型影响大，转化效率较低；且针刺法转化萝卜受顶端分生组织发育时间影响较大，且获得转基因植株数量较少。此外，萝卜开花结籽的时间周期较长，且具有自交不亲和性，收获的萝卜种子较少，限制了该技术广泛应用。目前萝卜关键基因功能验证只能在异源模式作物拟南芥和烟草中进行，除病毒诱导基因沉默(vigs)体系外，难以实现在本物种中进行基因功能验证。此外，由于缺乏高效稳定的萝卜遗传转化体系，无法在萝卜中利用基因编辑技术等进行目标性状精准改良与目的基因功能分析。因此，亟需建立一种稳定高效的萝卜目的基因遗传转化体系，解决萝卜分子育种中转化率低、转基因植株获得困难等问题。

技术实现思路

1、针对萝卜高效遗传转化体系尚未建立等问题，本发明的目的在于，提供一种根癌农杆菌介导的萝卜遗传转化方法及其应用，解决萝卜遗传转化效率低和耗时长的问题，为萝卜的高效转化和基因功能验证提供技术支撑。

2、本发明目的是通过以下技术方案实现的：

3、一种根癌农杆菌介导的萝卜遗传转化方法及其应用，包括以下步骤：

4、(1)取萝卜早抽薹高代自交系‘nau-lhz’带柄子叶作为外植体，置于ms固体培养基上预培养。

5、(2)将转化有重组表达载体的农杆菌菌液进行划线活化和培养，然后富集菌体，并用1/2ms液体培养基重悬作为侵染液。所述的重组表达载体为插入有目的基因的植物过表达载体。将所述的农杆菌菌液摇菌培养至od600为2.0左右，将1/2ms悬浮液悬浮离心收集的菌体，侵染液调至od600为0.5～0.8，优选od600为0.6～0.7。

6、(3)对步骤(1)中预培养后的带柄子叶进行侵染。将预培养后的带柄子叶和侵染液置于250ml锥形瓶内并使外植体完全浸入侵染液中，优选为100～150ml侵染液，28℃200rpm振荡容器，浸染时间约为15～30min，优选为20min。

7、(4)将侵染后的外植体置于ms固体培养基上，在黑暗条件下进行共培养，然后在脱羧培养基上诱导分化培养，继代培养直至分化出芽后，转到生根培养基中得到萝卜再生植株。

8、(5)步骤(1)和(4)中各培养基的配方为：

9、‘nau-lhz’带柄子叶的培养基配方：

10、预培养基：ms固体培养基

11、共培养基：ms固体培养基+200μmol/l as(乙酰丁香酮)

12、脱羧培养基：ms固体培养基+6-ba 6mg/l+naa 0.075mg/l+carb 300mg/l

13、生根培养基：1/2ms固体培养基+naa 0.3mg/l

14、步骤(1)中所述预培养的时间为2～4d，优选为3d。步骤(4)中在黑暗条件下进行共培养的时间为2～4d，优选为3d；诱导分化培养基每15d继代一次，优选为继代两次。

15、在培养过程中，除预培养、共培养和生根培养基外，其它每一步的培养基中6-ba与naa的添加比例均较高，使得外植体不断萌发新的侧芽。每次继代培养时，将分生出的小侧芽从母体分离，单独培养，可获得更多的芽。生根培养基需添加生长素naa，待其生根后炼苗移栽。通过ctab法提取疑似转基因萝卜叶片dna，采用pcambia1300通用引物扩增鉴定阳性转基因萝卜苗，之后通过rt-qpcr分析目的基因差异表达情况。此外，将电泳鉴定的萝卜转基因阳性苗自交，获得t2代株系后提取dna，采用通用引物扩增鉴定萝卜转基因阳性苗，t2代株系转化效率达46.15％。

16、本发明所述方法在具体的操作过程中可以根据需要选择不同目的基因和植物表达载体进行萝卜转基因实验，以高代自交系‘nau-lhz’带柄子叶为材料，以pcambia1300作为植物表达载体，构建pcambia1300-rsglk2.1的过表达载体，利用带柄子叶侵染进行转基因试验。

17、具体包括以下步骤：

18、1)以‘nau-lhz’带柄子叶为外植体。

19、2)选取苗龄在4～5d左右的无菌苗，去除茎尖，将选取的外植体置于预培养基上培养2～4d；所述预培养的配方为ms固体培养基。

20、3)农杆菌划线活化、培养及侵染液制备。将-80℃保存的转化有重组表达载体的农杆菌菌液在yeb固体培养基上活化，并用yeb液体培养基进行摇菌培养至od600为2.0，离心富集菌体，用1/2ms液体重悬至od600为0.6。

21、4)所述的重组表达载体以pcambia1300作为植物表达载体，构建的rsglk2.1基因的过表达载体pcambia1300-rsglk2.1。

22、5)侵染‘nau-lhz’带柄子叶。将步骤2中预培养3d后的带柄子叶从预培养基中拣出浸入侵染液中，28℃200rpm摇床振荡培养20min，以全部带柄子叶外植体沉底为标准。

23、6)将侵染后的带柄子叶捞出平摊于滤纸上吹干，换至新加有200μm as的ms固体培养基上，共培养2～3d。需将培养基放在黑暗条件下，使得农杆菌能够侵入外植体内。

24、使用羧苄青霉素抑制农杆菌的爆发，脱羧培养基为ms固体培养基+6-ba 6mg/l+naa0.075mg/l+carb 300mg/l。使用脱羧培养基对侵染后的带柄子叶进行诱导，每15d继代一次。带柄子叶出芽后无农杆菌爆发时转到去羧苄的生根培养基中培养(生根培养基：1/2ms固体培养基+iba 0.1mg/l)。继代培养时，应将分生出的小侧芽从母体分离，单独培养，增加转基因芽的阳性率。生根后通过ctab法提取疑似转基因萝卜叶片dna，采用pcambia1300通用引物扩增鉴定阳性转基因萝卜苗，之后通过rt-qpcr分析目的基因表达差异。此外，将电泳鉴定的萝卜转基因阳性苗自交，获得t2代株系，采用通用引物扩增鉴定萝卜转基因阳性苗。该方法显著提高了萝卜转基因的转化和筛选效率，而且大大缩短了获得转基因阳性苗时间。

25、本发明针对萝卜浸花法遗传转化体系建立耗时长、转化和筛选效率低等问题，提供了一种便捷的遗传转化方法，为萝卜的高效转化和基因功能分析提供新途径，也为其他再生困难植物的转基因提供了新思路。

技术特征：

1.一种根癌农杆菌介导的萝卜遗传转化方法及其应用，其特征在于包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法及其应用，其特征在于，步骤(1)中所述的外植体为萝卜‘nau-lhz’的带柄子叶。

3.根据权利要求1所述的方法及其应用，其特征在于，步骤(1)中外植体预培养时间为2～4d，优选为3d。

4.根据权利要求1所述的方法及其应用，其特征在于，步骤(2)中所述的活化培养后的农杆菌菌液od600为2.0左右，侵染液调整至od600为0.5～0.8，优选od600为0.6～0.7。

5.根据权利要求1所述的方法及其应用，其特征在于，步骤(3)中对带柄子叶进行侵染的具体方法为：将预培养后的外植体和侵染液置于250ml无菌锥形瓶中，将外植体完全浸入100～150ml侵染液中，28℃摇床200rpm振荡侵染15～30min，优选为20min。

6.根据权利要求1所述的方法及其应用，其特征在于，步骤(4)中在黑暗条件下进行共培养的时间为2～4d，优选为3d；所述脱羧培养时间为7～14d；每15d继代一次。

7.根据权利要求1所述的方法及其应用，其特征在于，步骤(1)和(4)中各固体培养基的配方如下：

8.根据权利要求1所述的方法及其应用，其特征在于，提取疑似萝卜转基因阳性株dna后，采用pcambia1300通用引物扩增鉴定萝卜转基因阳性苗。在此基础上，提取转基因阳性苗的rna并反转录成cdna，运用rt-qpcr分析目的基因表达情况，进一步证实目的基因成功转入萝卜植株中。

9.根据权利要求1所述的方法及其应用，其特征在于，将电泳鉴定的萝卜转基因阳性苗自交，获得t2代株系后提取dna，采用pcambia1300通用引物扩增鉴定萝卜转基因阳性苗，t2代株系转化效率可达46.15％。

10.权利要求1～9任一所述的方法适用于转基因萝卜植株的培育。

技术总结
本发明公开了一种根癌农杆菌介导的萝卜遗传转化方法及其应用，选取4～5d苗龄的萝卜‘NAU‑LHZ’带柄子叶为外植体，预培养3d后，用1/2MS液体培养基重悬农杆菌作为侵染液，将外植体于28℃ 200rpm摇床中振荡培养20min，放滤纸上晾干，在黑暗下共培养3d后转到脱羧培养基上分化培养，直至生根培养获得萝卜再生植株。提取萝卜叶片DNA，使用通用引物鉴定是否导入目的基因。同时采用RT‑qPCR验证目的基因是否过表达。此外，将电泳鉴定的萝卜转基因阳性苗自交，获得T2代株系后提取DNA，采用通用引物扩增鉴定萝卜转基因阳性苗，T2代株系转化效率达46.15％。与前人已报道的浸花法相比，本发明提高了转化和筛选效率，为萝卜高效转化和基因功能验证提供了新方法，也为萝卜等再生顽拗型作物的转基因研究提供了技术支撑。

技术研发人员：柳李旺,应佳丽,王燕,徐良,姚数琦,谢洋,沈峰,王爽
受保护的技术使用者：南京农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/22