一种提高产朊假丝酵母蛋氨酸产量的基因表达盒、表达载体、基因工程菌及方法和应用

本发明属于蛋白表达，具体涉及一种提高产朊假丝酵母蛋氨酸产量的基因表达盒、表达载体、基因工程菌及方法和应用。

背景技术：

1、奶牛养殖成本中饲草料成本一般占70％～80％，而饲草料成本的变化主要取决于蛋白饲料原料价格的上下波动。奶牛日粮中，由于“疯牛病”等原因，我国禁止用动物源性产品作为饲料原料，农作物副产品饼粕类是奶牛饲料蛋白的主要来源。在饼粕类蛋白饲料中，豆饼(粕)是氨基酸平衡相对较理想饲料原料，因而价格居高不下，为了降低成本只能在高产奶牛日粮中适量应用，在中低产奶牛日粮中少量应用或不敢用。为了拟补豆饼(粕)不足，通常在以谷物为基础的奶牛日粮中添加微生物蛋白(酵母、酵母培养物等)和过瘤胃氨基酸(赖氨酸和蛋氨酸)，供给奶牛充足的氨基酸，以获得最大的产奶量和乳蛋白产量。但又由于豆饼(粕)和酵母饲料中蛋氨酸含量偏低，达不到奶牛氨基酸平衡和需要的要求。过瘤胃氨基酸价格的昂贵，往往少添加或不添加，因此实际生产中很难达到理想的效果。

2、在绝大多数日粮情况下，蛋氨酸和赖氨酸是奶牛泌乳和乳蛋白合成的主要限制性氨基酸，在以玉米青贮为基础的日粮，蛋氨酸是乳汁和乳蛋白合成的第一限制性氨基酸。当日粮赖氨酸和蛋氨酸平衡之后，不仅可提高代谢蛋白的利用率、总的饲料利用效率、产奶性能及繁殖性能，同时还能减少代谢紊乱。国内外研究表明，奶牛补充过瘤胃保护蛋氨酸能增加产奶量、乳蛋白、乳脂肪及总固形物含量。且深刻认识到蛋氨酸作为反刍动物的重要限制性氨基酸对充分发挥动物生产潜能，降低粪、尿氮排放以及保护环境等方面起着巨大作用。

3、蛋氨酸又是一种功能性氨基酸。动物的产毛量，产奶量及产肉量都会受含硫氨基酸(蛋氨酸和胱氨酸)含量的限制。蛋氨酸可以刺激瘤胃微生物的生长，提高纤维的消化率和挥发性脂肪酸产量及微生物蛋白的合成。蛋氨酸在奶牛体内除合成蛋白质并很快转变成胱氨酸，还能提供活性甲基和羟基基团，供机体合成胆碱、角质素和核酸等，补充胆碱或维生素b12的部分作用，并能促进细胞增殖和动物生长。蛋氨酸还可利用其所带的甲基，对有毒或药物进行甲基化而起到解毒的作用。蛋氨酸除了参与动物体内甲基的转移、磷的代谢外，还参与肾上腺素和肌酸的合成。蛋氨酸对奶牛乳腺的发育以及乳汁的合成具有重要意义。但是，蛋氨酸主要存在于动物性蛋白中，植物性蛋白中含量较少，且动物体内不能直接合成，动物对蛋氨酸的需要只能靠外源补充。

4、玉米胚乳中玉米醇溶蛋白(zein)是天然存在的稳定型蛋白，富含含硫氨基酸(含有20％的蛋氨酸)，其中以δ-10kd型玉米醇溶蛋白中的含量最高，并且该蛋白在反刍动物的瘤胃中不被降解及具有肠溶性，可以巧妙地达到过瘤胃保护的目的。饲料酵母属于单细胞蛋白，安全可靠，生产周期短(酵母比植物蛋白质合成的能力强几百到几万倍，比动物快几十到几十万倍)，操作简单，生产成本低，营养价值很高，干物质中蛋白质含量可高达50％，其赖氨酸含量比大豆还高，接近动物蛋白，还含有b族维生素、矿物质以及其他生理活性物质，是一种多维高蛋白活性酵母饲料，但蛋氨酸含量偏低，用它作为蛋白饲料原料需添加蛋氨酸。其中，产朊假丝酵母和啤酒酵母、克鲁维酵母被美国fda认证为可作为食品添加剂的酵母，能运用于食品、制药业以及畜禽的饲料中。若将δ-10kd型玉米醇溶蛋白基因转化到产朊假丝酵母中，并应用于奶牛日粮中，可使奶牛日粮中的蛋氨酸含量提高，使赖氨酸和蛋氨酸趋于平衡，提高奶牛生产性能；使奶牛提高蛋白饲料的利用率，粪便中氮排泄量减少，减轻环境污染；可以直接作为安全的单细胞蛋白用于饲料，其发酵液不必经过分离纯化，省时且经济实惠。用该酵母工程菌生产的蛋白饲料应用于奶牛日粮中，可使奶牛日粮中不必添加过瘤胃包被氨基酸，也可以全部或部分代替奶牛日粮中的豆饼(粕)类蛋白饲料，使饲料成本显著降低。但目前表达zein的食品级产朊假丝酵母工程菌的蛋氨酸产量仍有待提高。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种提高产朊假丝酵母蛋氨酸产量的基因表达盒、表达载体、基因工程菌及方法和应用。本发明通过启动子强度的提高和同源信号肽的筛选，实现了蛋氨酸产量的提高。

2、本发明提供了一种gap-p突变的启动子gp6和同源信号肽sp8在提高产朊假丝酵母蛋氨酸产量中的应用；所述gp6的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述sp8的核苷酸序列如seq id no.2所示。

3、本发明还提供了所述基因表达盒含gap-p突变的启动子gp6、同源信号肽sp8和zein基因的核苷酸序列；所述gp6的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述sp8的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述zein基因的核苷酸序列如seq id no.3所示。

4、优选的是，所述基因表达盒还包括外源信号肽a-mf的pro区，所述外源信号肽a-mf的pro区的核苷酸序列如seq id no.4所示。

5、优选的是，所述基因表达盒的核苷酸序列如seq id no.5所示。

6、本发明还提供了一种含上述技术方案所述基因表达盒的表达载体。

7、本发明还提供了上述技术方案所述表达载体的构建方法，将上述技术方案所述的基因表达盒构建到基础质粒上，得到表达载体。

8、本发明还提供了含上述技术方案所述表达载体或上述技术方案所述构建方法得到的表达载体的基因工程菌。

9、优选的是，所述基因工程菌的基础菌包括产朊假丝酵母菌。

10、本发明还提供了上述技术方案所述的基因表达盒或上述技术方案所述的表达载体或上述技术方案所述构建方法构建得到的表达载体或上述技术方案所述的基因工程菌在提高蛋氨酸产量或作为食品或作为饲料添加剂中的应用。

11、本发明还提供了一种提高产蛋氨酸产量的方法，将上述技术方案所述基因工程菌在培养基中进行培养。

12、本发明提供了一种gap-p突变的启动子gp6和同源信号肽sp8在提高产朊假丝酵母蛋氨酸产量中的应用。利用gap-p突变的启动子gp6和同源信号肽sp8能够构建得到可以使产朊假丝酵母蛋氨酸产量得到提升的表达质粒，进而获得可以使产朊假丝酵母蛋氨酸产量得到提升的基因工程菌。试验结果表明，通过工程菌启动子强度的提高和同源信号肽的筛选，与含有野生型gap-p启动子(即未突变的gap-p启动子)的δ-zein工程菌相比，本发明的将筛选到的最优启动子和信号肽构建分泌表达δ-zein的工程菌蛋氨酸产量提高了21.09％。

技术特征：

1.一种gap-p突变的启动子gp6和同源信号肽sp8在提高产朊假丝酵母蛋氨酸产量中的应用；所述gp6的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述sp8的核苷酸序列如seq id no.2所示。

2.一种提高产朊假丝酵母蛋氨酸产量的基因表达盒，所述基因表达盒含gap-p突变的启动子gp6、同源信号肽sp8和zein基因的核苷酸序列；所述gp6的核苷酸序列如seq idno.1所示，所述sp8的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述zein基因的核苷酸序列如seqid no.3所示。

3.根据权利要求2所述的基因表达盒，其特征在于，所述基因表达盒还包括外源信号肽a-mf的pro区，所述外源信号肽a-mf的pro区的核苷酸序列如seq id no.4所示。

4.根据权利要求3所述的基因表达盒，其特征在于，所述基因表达盒的核苷酸序列如seq id no.5所示。

5.一种含权利要求2～4任一项所述基因表达盒的表达载体。

6.权利要求5所述的表达载体的构建方法，其特征在于，将权利要求2～4任一项所述的基因表达盒构建到基础质粒上，得到表达载体。

7.含权利要求5所述表达载体或权利要求6所述构建方法得到的表达载体的基因工程菌。

8.根据权利要求7所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的基础菌包括产朊假丝酵母菌。

9.权利要求2～4任一项所述的基因表达盒或权利要求5所述的表达载体或权利要求6所述构建方法构建得到的表达载体或权利要求7或8所述的基因工程菌在提高蛋氨酸产量或作为食品或作为饲料添加剂中的应用。

10.一种提高蛋氨酸产量的方法，其特征在于，将权利要求7或8所述基因工程菌在培养基中进行培养。

技术总结
本发明属于蛋白表达技术领域，涉及一种提高产朊假丝酵母蛋氨酸产量的基因表达盒、表达载体、基因工程菌及方法和应用。本发明提供了一种GAP‑P突变的启动子GP6和同源信号肽SP8在提高产朊假丝酵母蛋氨酸产量中的应用；所述GP6的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述SP8的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。本发明通过启动子强度的提高和同源信号肽的筛选，实现了蛋氨酸产量的提高。

技术研发人员：呼和,其布日,高娃,苏少锋,吴青海,王蕴华
受保护的技术使用者：内蒙古自治区农牧业科学院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13