一种枯草芽孢杆菌Cot-A漆酶的突变体、突变体基因及其应用

本发明属于基因工程及酶工程，具体涉及一种枯草芽孢杆菌cot-a漆酶的突变体、突变体基因及其应用。

背景技术：

1、多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons，pahs)是由两个或两个以上稠苯环组成的化合物，具有多种结构形态；这些不同结构形态的多环芳烃是由森林火灾、火山爆发等天然灾害或化石燃料、炼油、煤炭气化和废物焚化的不完全燃烧等人类活动所产生的。多环芳烃结构稳定、水溶性低，具有致癌、致畸和致突变效应，且作为一种持久性有机污染物，备受关注。虽然pahs水溶性低，在水中浓度小，但水环境中的pahs确分布广泛且污染面广，原因在于pahs容易从水中分配到沉积物中或生物体内，在沉积物和生物体内富集，破坏水生生态系统，并且通过呼吸道、皮肤和消化道进入人体，直接危害人体健康，所以多环芳烃污染的治理迫在眉睫。

2、漆酶(laccase，e.c.1.10.3.2)是一种含铜多酚氧化酶，一般含有四个铜离子，根据光谱和磁性特征可以将其分为三类：ⅰ型铜离子和ⅱ型铜离子各一个，是单电子受体，呈顺磁性；ⅲ型铜离子两个，是双电子受体，呈反磁性。这四个铜离子处于漆酶的活性部位，是漆酶表现催化活性的决定因素。i型铜原子(t1cu)单核位点是底物结合场所，接受电子后通过保守的组氨酸-半胱氨酸-组氨酸三肽传递至三核铜簇位点(包括两个ii型铜原子和一个iii型铜原子)，分子氧在此被还原为水。漆酶催化氧化有机物反应的机理主要是漆酶催化有机物单电子氧化，同时将氧分子还原成水。进而漆酶可以氧化包括苯并蒽、酚类污染物、多氯联苯及其衍生物、羧酸及其衍生物、芳胺及其衍生物和杀虫剂除草剂等在内的多种难降解的有机物。

3、发明人前期已从自行筛选的枯草芽孢杆菌菌株cota(b.pumilus cota)中克隆并表达了cota漆酶，研究发现该cota漆酶相对其他种类的漆酶具备以下优点：碱性条件下酶活性高、耐高温且热稳定性好、能耐受高浓度有机溶剂及卤素离子环境等，这些优良特性正是目前漆酶在处理多环芳烃领域进行工业化应用所急需的。然而，枯草芽孢杆菌cota野生型cota漆酶降解多环芳烃效果较差，难以进一步工业化应用。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种枯草芽孢杆菌cot-a漆酶的突变体、突变体基因及其应用，所述枯草芽孢杆菌cot-a漆酶的突变体较野生型枯草芽孢杆菌cot-a漆酶具备更高的多环芳烃降解率。

2、本发明提供了一种枯草芽孢杆菌cot-a漆酶的突变体，所述突变体与野生型枯草芽孢杆菌cot-a漆酶相比，第92位氨基酸由天冬氨酸突变为脯氨酸；

3、所述野生型枯草芽孢杆菌cot-a漆酶的氨基酸序列如uniprot中登录号为h8wge7所示的序列。

4、本发明还提供了一种枯草芽孢杆菌cot-a漆酶的突变体的编码基因，所述编码基因编码如上述技术方案所述的突变体。

5、本发明还提供了一种突变重组表达载体，包括初始载体和上述技术方案所述的突变体基因。

6、优选的，所述初始载体包括pet28a。

7、本发明还提供了上述技术方案所述突变重组表达载体的制备方法，包括如下步骤：以d92p突变引物对重组质粒pet28a-cot-a进行pcr扩增，得到所述突变重组表达载体；

8、所述d92p突变引物的正向引物的核苷酸序列如seq id no.1所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.2所示；

9、所述重组质粒pet28a-cot-a为通过将野生型枯草芽孢杆菌cot-a漆酶基因转入pet28a的启动子和终止子之间获得。

10、本发明还提供了一种重组菌，包括上述技术方案所述的突变体基因或重组表达载体。

11、本发明还提供了上述技术方案所述的突变体的制备方法，包括如下步骤：

12、采用诱导剂对上述技术方案所述的重组菌进行诱导表达，得到降解苯并蒽最好的单菌落，所述单菌落中包括所述突变体。

13、优选的，所述诱导表达的诱导剂为iptg。

14、本发明还提供了上述技术方案所述的突变体、突变体基因、突变重组表达载体或所述的制备方法制备得到的突变体在降解多环芳烃中的应用。

15、优选的，所述多环芳烃包括苯并蒽。

16、有益效果：

17、本发明提供了一种枯草芽孢杆菌cot-a漆酶的突变体，所述突变体为野生型枯草芽孢杆菌cot-a漆酶的第92位氨基酸由天冬氨酸突变为脯氨酸得到；所述野生型枯草芽孢杆菌cot-a漆酶的氨基酸序列如genebank中登录号为ago57931所示的序列。本发明所述的突变体较野生型枯草芽孢杆菌cot-a漆酶对包括苯并蒽在内的多环芳烃具有更高的催化效率、专一性和降解率，进一步提高枯草芽孢杆菌cot-a漆酶的工业化应用前景。

技术特征：

1.一种枯草芽孢杆菌cot-a漆酶的突变体，其特征在于，所述突变体为野生型枯草芽孢杆菌cot-a漆酶的第92位氨基酸由天冬氨酸突变为脯氨酸得到；

2.一种枯草芽孢杆菌cot-a漆酶的突变体的编码基因，其特征在于，所述编码基因编码如权利要求1所述的突变体。

3.一种突变重组表达载体，其特征在于，包括初始载体和权利要求2所述的编码基因。

4.根据权利要求3所述的突变重组表达载体，其特征在于，所述初始载体包括pet28a。

5.权利要求4所述突变重组表达载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：以d92p突变引物对重组质粒pet28a-cot-a进行pcr扩增，得到所述突变重组表达载体；

6.一种重组菌，其特征在于，包括权利要求2所述的突变体的编码基因或权利要求3或4所述的突变重组表达载体。

7.权利要求1所述的突变体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述诱导剂为iptg。

9.权利要求1所述的突变体、权利要求2所述的突变体基因、权利要求3或4所述的突变重组表达载体或权利要求7或8所述的制备方法制备得到的突变体在降解多环芳烃中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述多环芳烃包括苯并蒽。

技术总结
本发明属于基因工程及酶工程技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌Cot‑A漆酶的突变体、突变体基因及其应用。本发明所述突变体为野生型枯草芽孢杆菌Cot‑A漆酶的第92位氨基酸由天冬氨酸突变为脯氨酸得到；所述野生型枯草芽孢杆菌Cot‑A漆酶的氨基酸序列如UniProt中登录号为H8WGE7所示的序列。本发明所述的突变体较野生型枯草芽孢杆菌Cot‑A漆酶对包括苯并蒽在内的多环芳烃具有更高的催化效率、专一性和降解率，进一步提高枯草芽孢杆菌Cot‑A漆酶的工业化应用前景。

技术研发人员：彭馨,倪青云,张威,徐远涛,龙桥艺
受保护的技术使用者：湖南师范大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/11