经修饰的mRNA5`-帽类似物的制作方法

本发明涉及使用与信使rna的5'末端互补的核酸对rna的5'帽结构进行修饰，以影响所述rna的5'帽结构的改变，从而调节其功能。因此，本发明一般地涉及动物细胞中的基因表达，特别是蛋白质表达。

背景技术：

1、rna降解是基因表达调控的关键过程。任何功能性mrna，包括用于治疗的mrna，都必须被保护以免受rna降解机制的影响。然而，本质上的保护是暂时的，且可以通过适当的化学修饰来改善。近年来，体外转录(ivt)的mrna已成为治疗性基因合成的有希望的途径。由于恰当的mrna功能取决于其结构调节元件，包括mrna的5'-帽和3'端的polya修饰，因此这些元件在mrna稳定性中起关键作用。因此，对5'-帽结构的合理修饰可以通过提高rna稳定性和促进其细胞和体内翻译来提高mrna治疗剂的效力(nature reviews drugdiscovery,vol.17,261)。

2、在真核生物中，mrna上的7-甲基鸟苷5'-帽对于在体外和体内被蛋白质合成机制例如核糖体有效识别而言至关重要。在mrna制造过程中，共转录方法相比于转录后5'-帽方法而言更适合体外转录，这是因为它简单且高效(genes and development,vol.20,1838)。为了适用于共转录，已开发出含有7-甲基鸟苷以及5'-5'-三磷酸接头的二核苷酸和三核苷酸，称为cap-0、cap-1、arca和cleancap，且目前已用于获批的mrna covid-19疫苗和其他多种目前处于临床试验阶段的mrna(nature,vol.596,109)。已发表的关于5'-帽类似物的文献主要依靠7-甲基鸟苷(7mg)及其2'-和3'-取代基(us10925935b1,us9295717b2)、核苷酸间接头中的磷酸酯替换(us10570388b2)、诸如非桥接氧用硫部分的取代以得到硫代磷酸酯(us8153773b2)或诸如在中延长的核苷酸(us10519189b2)。然而，需要i)提高ivt中的加帽效率，ii)增加对脱帽机制的抵抗力，以及iii)通过使用非天然核苷修饰来替代7mg或使用尚未被开发的三磷酸修饰来改善与t7或其他聚合酶的结合。因此，我们设计、合成和评价了一系列用于mrna治疗程序的新型5'-帽结构，其具有多种性质：稳定性、转录和/或翻译有效性和耐久性。

技术实现思路

1、本公开提供了mrna 5'帽类似物以及它们的制备和使用方法。本公开还提供了含有5'帽类似物的mrna。

2、本发明的5'-帽类似物可以提高转录、mrna稳定性以及mrna翻译有效性和耐久性。

3、在一个方面，本公开提供了如下式(i)的化合物或其立体异构体、互变异构体或盐：

4、

5、其中：

6、环b1和b2各自独立地为核碱基或修饰的核碱基；

7、x1和x2独立地为-(c(r1)2)m-、-o-(c(r1)2)m-、-(c(r1)2)m-o-、-ch＝ch-(c(r1)2)m-、-(c(r1)2)m-ch＝ch-；其中m是0-6的整数；

8、y为–(r2-p(o)-r2)p-，其中p为0、1或2；

9、r11、r12、r23和r24独立地为h、卤素、or3或or4；

10、r13、r14、r21和r22独立地为h、卤素、or3、or4或lna；

11、每个r1独立地为h、卤素或c1-3烷基；

12、每个r2独立地为o、s、c1-6烷基，其中所述c1-6烷基任选取代有一个或多个卤素、oh；

13、每个r3独立地为h、c1-6烷基、c2-6烯基、c2-6炔基，其中所述c1-6烷基、c2-6烯基、c2-6炔基任选取代有一个或多个卤素、oh和c1-6烷氧基；

14、每个r4独立地为其中，每个b独立地为天然核碱基或修饰的核碱基且可为相同或不同的；

15、r31、r32、r43和r44各自独立地为h、卤素或or4’；

16、r41和r42各自独立地为h、卤素、or4’、lna；

17、每个r4’独立地为h、c1-6烷基、c2-6烯基、c2-6炔基，其中所述c1-6烷基、c2-6烯基、c2-6炔基任选取代有一个或多个卤素、oh和c1-6烷氧基；

18、r5独立地为oh或sh；

19、r6独立地为o或s；

20、每个r5’独立地为oh或sh；

21、每个r6’独立地为o或s；

22、n为选自0-2的整数。

23、在另一方面，本公开提供了如下式(ii)的化合物或其立体异构体、互变异构体、氘代物或盐：

24、

25、其中：

26、环b1、b2、b3和b4各自独立地为核碱基或修饰的核碱基；

27、每个r独立地选自h和c1-6烷基；

28、r1和r2各自独立地选自or5和卤素；

29、每个r3独立地选自c1-6烷氧基、卤素和lna；

30、每个r4独立地选自卤素和lna；

31、每个r5独立地选自h、c1-6烷基、c2-6烯基和c2-6炔基，其中所述c1-6烷基、c2-6烯基或c2-6炔基任选取代有一个或多个卤素、oh和c1-6烷氧基；和

32、n为选自0-1的整数。

33、本公开还提供了rna分子，其5'端含有式(i)的化合物。

34、在另一方面，本公开所提供的rna分子为mrna分子。

35、在另一方面，本公开所提供的mrna分子包含编码hpv e6-e7抗原多肽的多核苷酸序列，例如seq idno:1或seq id no:2所示的多核苷酸序列。

36、在另一方面，本公开提供了合成式(i)的化合物的方法。

37、在另一方面，本公开提供了体外合成rna分子(例如mrna)的方法。该方法可以包括使未修饰或修饰的atp、未修饰或修饰的ctp、未修饰或修饰的utp、未修饰或修饰的gtp、式(i)的化合物或其立体异构体、互变异构体或盐以及多核苷酸模板反应，该反应在rna聚合酶的存在下，在有利于经所述多核苷酸模板的rna聚合酶转录成一个或多个rna拷贝的条件下进行，其中至少一些所述rna拷贝掺入所述式(i)的化合物或其立体异构体、互变异构体或盐以得到rna分子(例如mrna)。

38、在另一方面，本公开提供了用于加帽rna转录物的试剂盒。该试剂盒包括式(i)的化合物和rna聚合酶。该试剂盒还可以包括一种或多种rna分子、核糖核酸酶抑制剂、酶缓冲液和核苷酸缓冲液。

39、此外，本申请所述的化合物或方法可用于研究(例如，研究体外rna转录物与某些酶的相互作用)和其他非治疗目的。

技术特征：

1.如下式(ii)的化合物或其立体异构体、互变异构体、氘代物或盐：

2.权利要求1的化合物、立体异构体、互变异构体、氘代物或盐，其中环b1和b4各自独立地为鸟嘌呤(g)，且环b2和b3各自独立地为腺嘌呤(a)。

3.权利要求1的化合物、立体异构体、互变异构体、氘代物或盐，其中r独立地选自h和甲基。

4.权利要求1的化合物、立体异构体、互变异构体、氘代物或盐，其中r1和r2各自独立地选自or5、f、cl、br和i，且每个r5独立地选自h和c1-6烷基，其中所述c1-6烷基任选取代有c1-6烷氧基。

5.权利要求1的化合物、立体异构体、互变异构体、氘代物或盐，其中r1和r2各自独立地选自oh、-o(ch2)2och3和f。

6.权利要求1的化合物、立体异构体、互变异构体、氘代物或盐，其中r3独立地选自甲氧基、f和lna。

7.权利要求1的化合物、立体异构体、互变异构体、氘代物或盐，其中r4独立地选自f和lna。

8.如下式(iia)的化合物或其立体异构体、互变异构体、氘代物或盐：

9.权利要求8的化合物、立体异构体、互变异构体、氘代物或盐，其中环b1和b4各自独立地为鸟嘌呤(g)，且环b2和b3各自独立地为腺嘌呤(a)。

10.权利要求8的化合物、立体异构体、互变异构体、氘代物或盐，其中r3和r4各自独立地选自f和lna。

11.如下式(iib)的化合物或其立体异构体、互变异构体、氘代物或盐：

12.权利要求11的化合物、立体异构体、互变异构体、氘代物或盐，其中环b1和b4各自独立地为鸟嘌呤(g)，且环b2各自独立地为腺嘌呤(a)。

13.权利要求11的化合物、立体异构体、互变异构体、氘代物或盐，其中r1和r2各自独立地选自or5、f、cl、br和i，且每个r5独立地选自h和c1-6烷基，其中所述c1-6烷基任选取代有c1-6烷氧基。

14.权利要求11的化合物、立体异构体、互变异构体、氘代物或盐，其中r1和r2各自独立地选自oh、-o(ch2)2och3和f。

15.选自以下任一的化合物、立体异构体、互变异构体、氘代物或盐：

16.rna分子，其5’端包含权利要求1-15中任一项的化合物、立体异构体、互变异构体、氘代物或盐。

17.权利要求16的rna分子，其为mrna分子，且所述mrna分子包含编码hpv e6-e7抗原多肽的多核苷酸序列(例如seq id no:1或seq id no:2所示的多核苷酸序列)。

18.用于加帽rna转录物的试剂盒，包括权利要求1-15中任一项的化合物、立体异构体、互变异构体、氘代物或盐，和rna聚合酶。

19.权利要求18的试剂盒，进一步包括rna分子。

20.权利要求19的试剂盒，其中所述rna分子为mrna分子，且所述mrna分子包含编码hpve6-e7抗原多肽的多核苷酸序列(例如seq id no:1或seq id no:2所示的多核苷酸序列)。

21.加帽rna转录物的方法，其使用权利要求1-15中任一项的化合物、立体异构体、互变异构体、氘代物或盐。

22.表达蛋白的方法，包括使用权利要求1-15中任一项的化合物、立体异构体、互变异构体、氘代物或盐翻译加帽的rna转录物。

技术总结
本发明提供了5’‑帽类似物，其可以提高转录、mRNA稳定性以及mRNA翻译效率和耐久性。本发明还涉及用于制备帽类似物和使用含有这种类似物的mRNA的方法，以及含有所述新的帽类似物的试剂盒。

技术研发人员：埃坎巴雷斯瓦拉·坎迪马拉,江军,毕胜,李鹏飞,拉克希米·巴加特,许鑫,普拉文·波古拉
受保护的技术使用者：南京吉迈生物技术有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/11