一种增强新冠突变株疫苗广谱性的方法及新冠广谱疫苗

本发明属于生物医药。更具体地，涉及一种增强新冠突变株疫苗广谱性、提高疫苗免疫保护效果的方法及新冠广谱疫苗。

背景技术：

1、新冠病毒的疫苗靶点主要包括全病毒或其结构蛋白，比如刺突蛋白(s)和膜蛋白(m)以及包膜蛋白(e)，目前已批准的疫苗包括灭活疫苗、dna疫苗、重组蛋白疫苗、mrna疫苗等，除灭活疫苗外均以病毒的s蛋白作为抗原，以刺激人体的免疫反应。由于s蛋白极易变异，omicron和原始野生型相比有32个spike突变，从单碱基突变造成氨基酸突变的角度来看，这已经是sars-cov-2进化的一种极限形式，对已有疫苗的保护造成了巨大的威胁。同时，我们及世界多个主流实验室发表的数据表明，早期病毒或者疫苗的免疫，新流行的突变株多产生严重的免疫逃逸。恢复期的新冠患者血浆也几乎无法识别除sars-cov-2以外的冠状病毒rbd，因此各疫苗公司和研究机构也在不断针对新的冠状病毒变异株更新迭代自家疫苗。

2、尽管我国人群已经广泛接种了基于新冠早期株研制的各种疫苗，展示了很高的保护率，但新冠变异株的不断涌现，疫苗“防重症，但不防感染”的趋势非常明显。然而等病毒(突变株)出现再研发针对性疫苗的策略已显得被动和滞后，研发最快的mrna疫苗从研发到临床使用也需耗时近8个月，在这段时间内，新变种很可能已经出现，旧变种也可能演变成了弱势株。因此，基于目前新冠病毒变异速度超过了疫苗研发速度的现状，为摆脱被动局面，广谱/通用疫苗的开发尤为迫切。

3、关于通用疫苗(universal coronavirus)，学界产业界有多种定义方式，关于通用冠状病毒疫苗目前主要有以下几种定义：①防covid-19变异株的疫苗(variant-proofcovid-19vaccines)，目的是能对已出现的多种新冠病毒变异株有保护力(减少感染和重症)。②泛sars冠状病毒疫苗(pan-sarbecovirus vaccines)，指能对非典冠状病毒、新冠病毒以及未来可能出现的sarbecovirus亚属的病毒具有保护力的疫苗。③泛β属冠状病毒疫苗(pan-betacoronavirusvaccines)，指针对多种现存的和将来可能出现的β属冠状病毒具有保护力的疫苗，包括sars、mers等。④泛冠状病毒疫苗(pan-cov vaccines)，指对多种现存的和将来可能出现的冠状病毒具有保护力的疫苗。显然，上述的第④号泛冠状病毒疫苗(pan-cov vaccines)是最理想也是最令人期待的疫苗，但目前要实现这一目标需要面临巨大的挑战和努力。而上述第①号防covid-19变异株的疫苗(variant-proof covid-19vaccines)和第②号泛sars冠状病毒疫苗(pan-sarbecovirus vaccines)是最有可能实现的疫苗。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是克服上述现有新型冠状病毒疫苗的问题与不足，研制一款基于马赛克纳米颗粒技术的新冠广谱/通用疫苗，应对新冠病毒目前和将来的变异株流行。

2、本发明的目的是提供一种增强新冠突变株疫苗广谱性的方法。

3、本发明再一目的是提供一种新冠广谱抗原。

4、本发明再一目的是提供一种用于制备所述新冠广谱抗原的重组质粒。

5、本发明再一目的是提供一种新冠广谱疫苗。

6、本发明上述目的通过以下技术方案实现：

7、为了解决新冠突变株疫苗广谱性较差的技术瓶颈，我们将两种策略结合在一起，一方面结合来自多个冠状病毒亚群的不同抗原并将其输送到机体，以刺激针对多种冠状病毒的免疫保护，另一方面寻找多种冠状病毒中常见的保守蛋白质结构，并将其用作抗原来开发疫苗；具体来说，我们通过将6种不同的新冠突变株rbd和6条在sarbecovirus的n和s蛋白上高度保守的cd8+t细胞表位肽段分别融合表达，再将这六种融合表达的蛋白抗原展示在同一纳米颗粒表面，形成我们原创的mosaic新冠纳米颗粒疫苗。通过比较mosaic新冠纳米颗粒疫苗诱导机体产生针对各种新冠突变株和sars等体液免疫和细胞免疫的应答情况，从而对其疫苗应用进行优化。

8、研究结果显示，我们制备的mosaic新冠纳米颗粒疫苗可克服新冠突变株剧烈突变引起免疫逃逸、造成免疫原性下降的问题，能显著提高宿主产生针对病毒的特异性抗体的水平，从而产生阻挡病毒入侵机体的能力，具有明显的广谱性。

9、因此，本发明提供一种增强新冠突变株疫苗广谱性的方法，将seq idno:6-11任一所示的cd8+t细胞表位肽段与seq id no:12-17任一所示的新冠突变株rbd连接后所得融合蛋白中的两个或两个以上的组合作为抗原使用。

10、优选地，是将seq id no:6-11所示的6条cd8+t细胞表位肽段分别与seq id no:12-17所示的6个新冠突变株rbd连接，得到6个融合蛋白，将6个融合蛋白组合作为抗原使用。

11、作为一种优选地实施方案，所述6个融合蛋白为：

12、gv-ba.1rbd-n395-403，氨基酸序列如seq id no:18所示，

13、gv-ba.2rbd-n316-333，氨基酸序列如seq id no:19所示，

14、gv-ba.5rbd-n360-369，氨基酸序列如seq id no:20所示，

15、gv-ba.2.75rbd-s539-546，氨基酸序列如seq id no:21所示，

16、gv-delta rbd-s1136-1155，氨基酸序列如seq id no:22所示，

17、gv-d614g rbd-s865-873，氨基酸序列如seq id no:23所示。

18、另外优选地，所述连接所使用的连接元件为gv/sd连接元件，氨基酸序列如seq idno:5所示。

19、进一步优选地，将所述融合蛋白共同展示在同一纳米颗粒表面形成马赛克纳米颗粒抗原。

20、本发明还提供一种新冠广谱抗原，其为seq id no:6-11任一所示的cd8+t细胞表位肽段与seq id no:12-17任一所示的新冠突变株rbd连接得到的融合蛋白中的两个或两个以上的组合。

21、优选地，所述连接所使用的连接元件为gv/sd连接元件，氨基酸序列如seq id no:5所示。

22、进一步优选地，将所述融合蛋白共同展示在同一纳米颗粒表面，得到马赛克纳米颗粒抗原。

23、优选地，所述新冠广谱抗原为seq id no:6-11所示的6条cd8+t细胞表位肽段分别与seq id no:12-17所示的6个新冠突变株rbd连接，得到6个融合蛋白，将6个融合蛋白共同展示在同一纳米颗粒表面，形成马赛克纳米颗粒抗原。

24、作为一种优选地实施方案，所述6个融合蛋白为：

25、gv-ba.1rbd-n395-403，氨基酸序列如seq id no:18所示，

26、gv-ba.2rbd-n316-333，氨基酸序列如seq id no:19所示，

27、gv-ba.5rbd-n360-369，氨基酸序列如seq id no:20所示，

28、gv-ba.2.75rbd-s539-546，氨基酸序列如seq id no:21所示，

29、gv-delta rbd-s1136-1155，氨基酸序列如seq id no:22所示，

30、gv-d614g rbd-s865-873，氨基酸序列如seq id no:23所示。

31、作为一种可选择的实施方案，所述新冠广谱抗原的制备方法如下：

32、将6种gv-rbd-cd8+t peptide单体蛋白(氨基酸序列seq id no:18-23)混合液(优选按等比例混合在ph＝7.5 20mm tri-hcl 50mm nacl缓冲液中)与sdcatcher-hpf蛋白(氨基酸序列如seq id no:3)在缓冲体系中室温震荡孵育(优选孵育1小时)偶联，得到偶联好的mosaic-nanoparticle(np)，即为新冠广谱抗原(马赛克mosaic纳米颗粒抗原)。

33、优选地，所述缓冲体系为ph＝7.5 20mm tri-hcl 50mm nacl缓冲体系。

34、另外，本发明还提供一种用于表达制备所述新冠广谱抗原的重组质粒，其包含上述gv-rbd-cd8+t peptide单体蛋白的编码序列。

35、优选地，所述用于表达制备gv-rbd-cd8+t peptide单体蛋白的重组质粒为：以seqid no:18-23所示融合蛋白gv-rbd-cd8+t peptide的核苷酸序列为基础，将融合蛋白上gv/sd连接元件和rbd之间用linker gsg隔开，并在融合蛋白5’加上分泌肽sp(氨基酸序列seqid no:4)的核苷酸序列，在融合蛋白3’端加上6xhis和翻译终止密码子；然后克隆到添加了intron以及wpre增强表达的表达载体(pcdna3.1-intron-wpre)的xho i和xba i酶切位点之间，构建得到表达载体pcdna3.1-intron-sp-gv-rbd-cd8+t peptide-his-ires-gfp-wpre，即为用于制备所述新冠广谱抗原的重组质粒。

36、将该重组质粒瞬时转染真核表达系统(如293f细胞)即可进行纳米抗原的表达，表达后收集细胞上清，纯化，即得到gv-rbd-cd8+t peptide单体蛋白(新型冠状病毒6种rbd融合蛋白单体)。

37、所述真核表达系统包括但不限于hek293t细胞、293f细胞、cho细胞、sf9等可用于表达真核蛋白的细胞株、细胞系。相应蛋白导入真核表达系统的方案包括但不限于各种转染、感染、转座方案等。

38、作为可选择的实施方案，所述纯化方法是将表达所述抗原的细胞上清液过滤除去细胞碎片，并通10k超滤管(millipore)进行初步的提纯，随即通过histrap hp镍柱(ge)、lectin柱(ge)进行目的蛋白的捕获，最后通过使用siperose6increase10/300gl柱子(ge)进行分子筛层析进行纯化，获取高纯度的目的蛋白(本文实施例的如图6所示)。

39、最后，本发明还提供一种新冠广谱疫苗，其由上文所述抗原制备得到。

40、作为可选择的实施方案，可以根据需要，制成喷鼻式疫苗、吸入式疫苗，也可制成注射式疫苗，以实现不同的免疫接种方式。

41、本发明具有以下有益效果：

42、本发明提供了本发明提供一种增强新冠突变株疫苗广谱性的方法以及一种新冠广谱疫苗。

43、在抗原选择上，我们针对目前世界范围主要流行的新冠突变株omicron，选取了ba.1，ba.2，ba.5和ba.2.75四种亚型的rbd，再结合之前的主要流行株delta株和原始株的rbd，将这六种新冠突变株的rbd展示在同一纳米颗粒表面，形成我们原创的mosaic新冠纳米颗粒疫苗。此外，创新性的将6条在sarbecovirus的n和s蛋白上高度保守的cd8+t细胞表位肽段，分别与上述的6种新冠亚株rbd蛋白融合表达，不仅能对不同种rbd蛋白进行定量标识作用，还更进一步显著提升疫苗的细胞免疫应答，提升其在新冠和sars等sarbecovirus上的广谱性。

44、我们利用幽门螺旋杆菌铁蛋白(helicobacter pylori_ferritin,hpf)能够自发形成二十四聚体化的特性，将上述六种新冠病毒亚株的受体结合域(receptor bindingdomain,rbd)抗原通过自主研发优化的连接元件肽段完成疫苗组装，将免疫原rbd展示在纳米颗粒表面，聚集在一起形成纳米颗粒，增加单次免疫承载抗原的数量，并充分稳定其与人体内免疫细胞的广泛接触而刺激产生高效价中和抗体。

45、研究结果显示，本发明的方案可克服新冠突变株剧烈突变引起免疫逃逸、造成免疫原性下降的疫苗设计问题，所优化设计的疫苗免疫原，显著提高宿主产生针对病毒的特异性抗体的水平，从而产生阻挡病毒入侵机体的能力，具有效价高、副作用低、安全性高的优点。而且本发明纳米颗粒疫苗具备制备方法简单、易于纯化、生产和保存成本低、疫苗可较快的应用于临床试验的优势。

46、另外，本发明的新冠广谱疫苗可适用多种接种方式，喷鼻免疫、吸入式免疫或注射免疫；其中喷鼻免疫、吸入式免疫的方式在应对新冠病毒疫苗接种工作上具有更便利、预防感染和阻断传播更有效等优势。