一种基于惯性螺旋微流控芯片和双抗磁珠实现对CTC的增强捕获与高效释放的方法

本发明涉及肿瘤研究领域，尤其涉及一种基于惯性螺旋微流控芯片和双抗磁珠实现对ctc的增强捕获与高效释放的方法。

背景技术：

1、循环肿瘤细胞(ctc)是一种自发从主要病灶脱落的肿瘤细胞，ctc的早期检测和表征对癌症的诊断和适当治疗至关重要，但在肿瘤病人患者血液中含量极低，因此对其分选的灵敏度和特异度需求也较高。低浓度的ctc在血液中主要通过基于免疫亲和的方法、基于尺寸的方法、基于密度的方法进行富集。其中基于免疫亲和的阳性富集方法使用较多，其原理是靶向ctc表面抗原。目前研究中使用最多的ctc表面抗原是epcam。大多数ctc分离技术均来自于较为经典的实验原理和操作方法,尤其是大量广泛使用的有核细胞富集和白细胞负选原理，即将血液中的有核细胞进行富集，并将红细胞进行去除，再在富集的细胞中采用cd45单抗磁珠去除白细胞，最后用抗体(epcam、ck等)特异性阳性磁珠或磁棒吸附筛选肿瘤细胞，或抗体染色(epcam，ck等)进行肿瘤细胞鉴定和挑选。在有核细胞富集的步骤中，基于ficoll密度梯度分选法和红细胞裂解液去除红细胞法的原理所衍生的ctc分选方法应用最广，且这两种方法均可以配合抗体磁珠和荧光抗体染色技术进行ctc的手工分选富集。同样采用红细胞裂解液自动分选法的流式细胞仪广泛用于高校的医学生物学研究中。但由于上述设备不仅通常非常昂贵，且许多设备因技术局限性等原因造成多数设备仅能计数、并不能分离和进行下游其他应用,并且由于ctcs是异种细胞的集合，形态大小，基因表达，蛋白表达都不同，导致表面抗原的异质性而丢失ctc亚群(epcam阴性细胞)信息。

2、为了克服上述问题，需要开发一些新的替代技术。cd146是一种存在于人类黑色素瘤细胞质膜上的糖蛋白，参与调控血管生成、血管通透性和白细胞转运，在血管功能的控制中发挥着关键作用。微流控芯片可以在微米尺度空间自动化完成分选、处理、分析等过程，同时芯片的大小与细胞匹配，在ctc分选方面具有巨大的潜力，但该项技术尚未得到全面应用。

技术实现思路

1、本发明的目的是克服现有技术存在的缺陷，提供一种基于惯性螺旋微流控芯片和双抗磁珠实现对ctc的增强捕获与高效释放的方法，通过构建集合螺旋芯片与双抗磁珠用于血液中ctc的分离与捕获，通过mmp-9降解明胶用于ctc的无损伤释放，实现了保持ctc高活性的同时高效释放ctc。

2、实现本发明目的的技术方案是提供一种基于惯性螺旋微流控芯片和双抗磁珠实现对ctc的增强捕获与高效释放的方法，包括以下步骤：

3、s1、高通量血液经过螺旋芯片分选ctc，血细胞从螺旋通道外侧流出，ctc从螺旋通道内侧流出；

4、s2、ctc通过螺旋通道内侧进入磁珠混合区域；

5、s3、cd146联合anti-epcam抗体修饰的双抗磁珠在芯片混合区域对异质性ctcs进行高效捕获；

6、s4、利用mmp-9降解磁珠表面的明胶，在保持ctc高活性的同时高效释放ctc。

7、所述螺旋芯片是基于惯性螺旋微流控芯片，包括两个y型入口，其中靠近螺旋内壁的是缓冲液入口，靠近外壁的是样本入口，9/4圈螺旋通道组成螺旋主通道，由半径为4mm半圆开始，相邻流道间隔2mm，主流道宽度为500μm，高度为150μm，芯片尺寸在10μm，位于芯片外部的y形接口为芯片的两个出口，一个为靠近螺旋内圈流道较细的出口，一个为靠近螺旋外圈流道较宽的出口。

8、所述的螺旋通道具体流速参数为：样品流速300μl/min和pbs流速900μl/min将样品血液注入芯片。

9、所述双抗磁珠为epcam和cd146两种抗体修饰的磁珠，biotin-anti-epcam和biotin-anti-cd146浓度均为10μg/ml。

10、所述双抗磁珠的具体制备步骤如下：氨基磁珠加入戊二醛溶液，用锡纸包裹避光室温反应将磁珠表面的氨基活化，引入醛基，加入1％的明胶溶液，室温下均匀搅拌，通过磁珠表面的醛基与明胶的氨基相互作用将明胶均匀包裹在磁珠的表面，形成fe3o4@gelatin。将fe3o4@gelatin溶液与edc/nhs的混合溶液，重悬于sa溶液，磁珠重悬于双抗溶液中，使磁珠与抗体结合。

11、所述mmp-9浓度为0.1mg/ml。

12、采用上述技术方案后，本发明具有以下积极的效果：

13、(1)本发明通过构建集合螺旋芯片与双抗磁珠用于血液中ctc的分离与捕获，通过mmp-9降解明胶用于ctc的无损伤释放，实现了保持ctc高活性的同时高效释放ctc。

14、(2)本发明螺旋芯片可以高通量(18ml/h)处理血样，ctc的回收率为98％，血细胞的去除率为99％。

15、(2)本发明通过双抗(epcam和cd146)修饰的磁珠与螺旋出口ctc混合，实现了对异质性ctc的高效捕获，相比单独使用epcam抗体，捕获效率提高了20％。

16、(3)本发明mmp-9释放ctc效率高达90％，对细胞活力和正常分化无影响。

17、(4)本发明构建的ctc捕获与释放方法操作简单，自动化程度高，可以实现异质性ctc的高效捕获，为临床进一步分析ctc提供了可靠的方法。

技术特征：

1.一种基于惯性螺旋微流控芯片和双抗磁珠实现对ctc的增强捕获与高效释放的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的基于惯性螺旋微流控芯片和双抗磁珠实现对ctc的增强捕获与高效释放的方法，其特征在于：所述螺旋芯片是基于惯性螺旋微流控芯片，包括两个y型入口，其中靠近螺旋内壁的是缓冲液入口，靠近外壁的是样本入口，9/4圈螺旋通道组成螺旋主通道，由半径为4mm半圆开始，相邻流道间隔2mm，主流道宽度为500μm，高度为150μm，芯片尺寸在10μm，位于芯片外部的y形接口为芯片的两个出口，一个为靠近螺旋内圈流道较细的出口，一个为靠近螺旋外圈流道较宽的出口。

3.根据权利要求1所述的基于惯性螺旋微流控芯片和双抗磁珠实现对ctc的增强捕获与高效释放的方法，其特征在于：所述的螺旋通道具体流速参数为：样品流速300μl/min和pbs流速900μl/min将样品血液注入芯片。

4.根据权利要求1所述的基于惯性螺旋微流控芯片和双抗磁珠实现对ctc的增强捕获与高效释放的方法，其特征在于：所述双抗磁珠为epcam和cd146两种抗体修饰的磁珠，biotin-anti-epcam和biotin-anti-cd146浓度均为10μg/ml。

5.根据权利要求4所述的基于惯性螺旋微流控芯片和双抗磁珠实现对ctc的增强捕获与高效释放的方法，其特征在于：所述双抗磁珠的具体制备步骤如下：氨基磁珠加入戊二醛溶液，用锡纸包裹避光室温反应将磁珠表面的氨基活化，引入醛基，加入1％的明胶溶液，室温下均匀搅拌，通过磁珠表面的醛基与明胶的氨基相互作用将明胶均匀包裹在磁珠的表面，形成fe3o4@gelatin。将fe3o4@gelatin溶液与edc/nhs的混合溶液，重悬于sa溶液，磁珠重悬于双抗溶液中，使磁珠与抗体结合。

6.根据权利要求1所述的基于惯性螺旋微流控芯片和双抗磁珠实现对ctc的增强捕获与高效释放的方法，其特征在于：所述mmp-9浓度为0.1mg/ml。

技术总结
本发明涉及一种基于惯性螺旋微流控芯片和双抗磁珠实现对CTC的增强捕获与高效释放的方法。基于惯性螺旋微流控芯片和双抗磁珠实现了对异质性CTC的增强捕获与无损伤释放。首先，高通量血液经过螺旋芯片实现CTC与血细胞有效分离，血细胞从螺旋通道外侧流出，CTC通过螺旋通道内侧进入磁珠混合区域；CD146联合anti‑EpCAM抗体修饰的磁珠在芯片混合区域对异质性CTCs进行高效捕获；最后利用MMP‑9降解磁珠表面的明胶，实现了保持CTC高活性的同时高效释放CTC。本发明构建的CTC捕获与释放方法操作简单，自动化程度高，可以实现异质性CTC的高效捕获，为临床进一步分析CTC提供了可靠的方法。

技术研发人员：余绍宁,李巧玉,高文静,冯彬
受保护的技术使用者：宁波大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13