一株降解烟碱的烟草内生肠杆菌CYLOB及其应用

本发明属于微生物领域，具体涉及一株降解烟碱的烟草内生菌及其应用。

背景技术：

1、烟草中高含量的烟碱(nicotine，又称尼古丁)一直是吸烟者健康问题的重大隐患。尼古丁是烟草的主要成分，其本质是存在于茄科植物中的一类生物碱，它能与人脑中的烟碱乙酰胆碱受体结合，刺激脑中兴奋性神经递质多巴胺的分泌量增加。因此，人吸烟后，摄入体内的尼古丁会使人产生愉悦感，从而形成对尼古丁生理上和心理上的依赖性。但是，长期吸烟会导致人各种系统的功能损害，大大增加罹患肺癌和严重的心血管疾病的几率。此外，烟草废弃物中的烟碱还会污染环境。因此，降低烟草和烟草废弃物中的烟碱含量对人体健康和环境保护有着重大的现实意义。

2、目前降低烟草内烟碱的含量，主要可从烟草的生长过程和加工过程两方面着手。在烟草加工过程中，通过物理(增加过滤作用)或化学手段(加入与生物碱结合的添加剂)来降低烟碱含量。在烟草生长过程中，可通过1)调整烟草种植条件；2)利用遗传育种培养低含量烟碱的烟草品种；3)利用微生物降解烟草里的烟碱含量。用物理或化学的方法处理烟叶中的烟碱可以达到一定的分解和降低效果，但同时也损失了烟草中一些其他的化学成分，使烟草质量下降；通过改变环境降低烟草内烟碱含量，应用范围窄，成本高。利用微生物降解烟草烟碱可以在不改变烟草内在其他化学成分的同时，降低烟叶中尼古丁的含量。然而，目前研究发现的降解烟草烟碱的微生物大部分是从种植烟草的土壤、烟草废弃物中找到的，筛出来的菌不能在烟草叶中生存，或者会对烟草植株致死，没有从烟草叶本身解决烟碱含量高的问题。

3、近年来，利用烟草内生菌来降低烟草中的烟碱含量，日益受到国内外研究人员的重视。赵丽萍等从烟叶样品中分离出一株内生巴氏微杆菌(microbacterium barkeri)11l140,该菌株在烟碱浓度为1‰和2‰的条件下培养54h后,烟叶中烟碱的降解效率高达98.76％和89.52％。张天栋等从云南烤烟b2f烟叶中分离出一株内生粗糙脉孢霉菌(neurospora crassa)hbbb201,其发酵液添加到玉溪上部烟叶中,经恒温恒湿处理5d后,玉溪上部烟叶中的烟碱和亚硝酸盐含量分别降低33.9％和19.2％。苏丹等从福建三明烟区的烟草植株中筛选得到一株具有高效降烟碱特性的内生菌假单胞菌y5。当烟碱浓度为1.5,2.0,3.0g·l-1，菌株y5在48h基本完全降解烟碱，降解率分别为99％、99％和96％。林智慧等从烟叶样本中筛选出一株具有高效烟碱降解功能的内生菌g16，经过24h的培养可达到约90％的降解率。申星等从湖南浏阳官渡烟草基地烟草植株中分离了菌株t11，经鉴定为芽孢杆菌(bacillus sp.)，其烟碱降解为75.2％。

4、目前，烟草内生菌降解烟碱的研究，所用的烟碱起始浓度较低(≤3.0g·l-1)，且关于烟草内生肠杆菌对于烟碱的降解研究还未有报道。目前大部分研究都停留在菌种鉴定，生理生化特性分析和尼古丁降解实验，没有进行烟草活体实验。由于内生细菌的特殊性，只有通过将其定殖回烟草植株，才能直观地确定它们是否具有致病性或降低尼古丁含量。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题为：提供一株能够耐高尼古丁浓度并具有高降解效率的烟草内生肠杆菌。

2、本发明的技术方案为：一株肠杆菌(enterobacter sp.)cylob，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:m 20221712，保藏日期为2022年11月02日。

3、肠杆菌(enterobacter sp.)cylob的16s rdna序列如序列表1所示。

4、肠杆菌(enterobacter sp.)cylob在降解尼古丁中的应用。

5、肠杆菌(enterobacter sp.)cylob在调整烟草尼古丁含量中的应用。

6、进一步地，所述烟草为烟草活体植株。

7、进一步地，通过注射的方式使肠杆菌(enterobacter sp.)cylob侵染烟草活体植株，从而降低烟草活体植株中尼古丁的含量。

8、本发明相较于目前已发现的降解烟碱的方法最大的不同在于用来降解烟碱的是烟草内生菌。因此可避免烟草中其他化学成分的损失从而导致的烟草质量下降。内生菌降解烟草烟碱的应用范围广，成本低，且具有高效性，高选择性以及专一性，对环境的污染也相对减少。目前研究发现的降解烟草烟碱的微生物大部分是从种植烟草的土壤、烟草废弃物中找到的，筛出来的菌不能在烟草叶中生存，没有从烟草叶本身解决烟草烟碱含量高的问题。但是内生菌与植物宿主之间可以通过基因重组、信息交流或协同宿主植物合成次级代谢物促使宿主植物表现出一定的应激耐受性、促生性、固氮作用等，所以通过从烟草组织中筛出有降解烟碱特性的内生菌，来实现从烟草叶降低烟碱含量是有很大发展空间的。此外，目前对能够降解烟碱的烟草内生菌也有过相关研究报导，但都未能确保将内生菌侵染到烟草植株不会对其生长造成不良影响。故本发明除了筛选出能够降解烟碱的烟草内生菌外，还进行了内生菌侵染烟草植株的实验，确保其对植株生长不会造成不良影响，同时也通过测量烟草植株在注射内生菌后的烟碱含量变化验证了该内生菌实际应用于降解烟草内烟碱含量的可行性。

9、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

10、本发明的肠杆菌(enterobacter sp.)cylob对烟草烟碱具有较好的降解能力，能够能在4.0g/l尼古丁的lb培养基中生长，最高耐受力达到8g/l尼古丁，可用于尼古丁的降解。肠杆菌(enterobacter sp.)cylob来源于烟草植株组织内，为烟草内生菌，可以用于调整烟草植株的烟碱含量。

11、保藏信息：

12、肠杆菌(enterobacter sp.)cylob，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号：cctcc no:m 20221712，保藏日期为2022年11月02日。

技术特征：

1.一株肠杆菌(enterobacter sp.)cylob，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:m 20221712，保藏日期为2022年11月02日。

2.权利要求1所述的肠杆菌(enterobacter sp.)cylob在降解尼古丁中的应用。

3.权利要求1所述的肠杆菌(enterobacter sp.)cylob在调整烟草尼古丁含量中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述烟草为烟草活体植株。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，通过注射的方式使肠杆菌(enterobactersp.)cylob侵染烟草活体植株，从而降低烟草活体植株中尼古丁的含量。

技术总结
本发明公开了一株烟草内生肠杆菌(Enterobacter sp.)CYLOB，其对烟草烟碱具有较好的降解能力，能够能在4.0g/L尼古丁的LB培养基中生长，最高耐受力达到8g/L尼古丁。将此内生菌定植于烟草中，侵染40天后检测烟草叶片中尼古丁的含量下降54％。可用于烟草尼古丁的降解。

技术研发人员：喻雪婧,王行国,李亚东,吴姗,李林洁,陈丹,杨宇航,李润佳
受保护的技术使用者：湖北大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12