纳米抗体Nb7及其编码基因、重组载体、重组菌株和菌剂以及它们的应用

本发明涉及生物医药工程技术，具体涉及一种纳米抗体nb7及其编码基因、重组载体、重组菌株和菌剂以及它们的应用。

背景技术：

1、猪蓝耳病(pathogenic blue ear disease)，学名又叫“猪繁殖与呼吸综合征(prrs)”，是一种由猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)引起的呼吸道症状和繁殖障碍的动物疫病。被感染的猪只会产生短暂性两耳呈现蓝紫色的病症，并导致流产、弱仔、呼吸困难等后果，不同年龄、不同品种以及不同性别的猪只均对prrsv病毒具有易感性，其中仔猪以及妊娠母猪为易感对象，急性型发病母猪和仔猪的综合死亡率在40％以上，给我国的养猪业造成了极大的经济损失。

2、感染prrsv的动物包括发病猪只和带毒的猪只，是本病最主要传染源。prrsv大多数是经过接触进行传播的，呼吸道是该病毒最主要的感染途径，同时也可以通过垂直传播的方式进行传播。目前，已采取多种方式来控制养殖场的prrsv感染，这些措施包括对公猪的精液以及后备母猪进行prrsv检测，移出血清反应阳性的动物，畜群的减少和再填充以及畜群的封闭等。但是，在较大的区域内控制和消除prrsv要复杂得多，上述手段操作繁琐且效率较低。因此，迫切需要有效预防和控制prrsv的方法。

3、纳米抗体分子量小、特异性和亲和力强，灵活度和单克隆抗体相媲美，并且能通过细菌表达系统高效表达，即制备过程简单、成本低廉，因此已被广泛应用于感染性疾病的治疗。但是，纳米抗体的筛选以及递送方式不便、药效持续时间不理想限制了其在prrsv预防和治疗中的应用与发展。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了克服现有技术存在的prrsv纳米抗体筛选受限以及递送方式不便、药效持续时间不理想的问题，提供一种纳米抗体nb7及其编码基因、重组载体、重组菌株和菌剂以及它们的应用，该纳米抗体能够特异性结合猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)，对prrsv病毒具有良好的中和活性。

2、为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种纳米抗体nb7，所述纳米抗体nb7包括：

3、(1)氨基酸序列如seq id no:1所示的蛋白质；

4、(2)氨基酸序列如seq id no:1所示的蛋白质经改造获得的与改造前具有相同活性的衍生蛋白质。

5、优选地，所述改造包括：

6、i、将seq id no:1所示的氨基酸序列中的一个或几个氨基酸残基进行取代、缺失和添加中的至少一种；和/或

7、ii、在seq id no:1所示的氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有便于纯化的标签；和/或

8、iii、在seq id no:1所示的氨基酸序列的氨基末端连接有利于蛋白分泌表达的信号肽序列。

9、优选地，所述便于纯化的标签选自poly-arg、poly-his、flag、strep-tag ii和c-myc中的至少一种，更优选为poly-his。

10、优选地，所述信号肽序列为pelb。

11、本发明第二方面提供一种编码纳米抗体的基因，该基因具有编码前述的纳米抗体nb7的核苷酸序列。

12、优选地，所述基因具有编码具有seq id no:1所示氨基酸序列的核苷酸序列。

13、优选地，所述基因具有seq id no:2所示的核苷酸序列。

14、本发明第三方面提供一种重组载体，所述重组载体含有前述的基因。

15、优选地，所述重组载体的表达载体为ptrc99a载体。

16、本发明第四方面提供一种重组菌株，所述重组菌株含有前述的基因或者前述的重组载体。

17、优选地，所述重组菌株选自大肠杆菌、酵母菌、乳酸菌和枯草芽孢杆菌中的至少一种。

18、更优选地，所述重组菌株为大肠杆菌nissle1917。

19、本发明第五方面提供一种菌剂，所述菌剂包含前述的重组菌株。

20、优选地，所述菌剂为液态菌剂和/或固态菌剂。

21、本发明第六方面提供前述的纳米抗体nb7、前述的基因、前述的重组载体、前述的重组菌株或者前述的菌剂在制备预防和/或治疗猪蓝耳病的药物中的应用。

22、通过上述技术方案，本发明的有益效果为：

23、本发明提供了一种通过分子生物学方法构建获得的纳米抗体nb7，经试验验证，其能够特异性结合猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)，对prrsv病毒具有良好的中和活性，这表明该纳米抗体能够单独或与其他抗体配合作为活性组分，发挥对prrsv病毒的防治作用。

24、本发明进一步提供了一种重组菌株，以益生菌大肠杆菌nissle1917作为出发菌株，转化入含有本发明提供的纳米抗体nb7的重组载体获得，通过益生菌在肠道定植从而在体内能不断生成纳米抗体nb7，中和靶病毒，实现基于益生菌递送该纳米抗体进入猪的体内从而预防猪蓝耳病的效果，不会出现纳米抗体剂量过低、过高或者停留时间过短而不能发挥作用；由于益生菌的粘附作用，其可以在黏膜侵入点建立第一道防线，阻止prrsv病毒侵入机体，有效解决普通疫苗给药不便、药效持续时间不理想的问题。

25、本发明提供的纳米抗体nb7及含有该纳米抗体的重组菌株有望应用于简便、高效、廉价地生产针对猪蓝耳病的疫苗或者特效药，可服务广大养殖户，提升农村经济，具有重要的经济和社会意义。

技术特征：

1.一种纳米抗体nb7，其特征在于，所述纳米抗体包括：

2.根据权利要求1所述的纳米抗体nb7，其特征在于，所述改造包括：

3.一种编码纳米抗体的基因，其特征在于，该基因具有编码权利要求1或2所述的纳米抗体nb7的核苷酸序列。

4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于，所述基因具有编码具有seq id no:1所示氨基酸序列的核苷酸序列；

5.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有权利要求3或4所述的基因；

6.一种重组菌株，其特征在于，所述重组菌株含有权利要求3或4所述的基因或者权利要求5所述的重组载体。

7.根据权利要求6所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株的出发菌株选自大肠杆菌、酵母菌、乳酸菌和枯草芽孢杆菌中的至少一种；

8.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂包含权利要求6或7所述的重组菌株。

9.根据权利要求8所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂为液态菌剂和/或固态菌剂。

10.权利要求1或2所述的纳米抗体nb7、权利要求3或4所述的基因、权利要求5所述的重组载体、权利要求6或7所述的重组菌株或者权利要求8或9所述的菌剂在制备预防和/或治疗猪蓝耳病的药物中的应用。

技术总结
本发明涉及生物医药工程技术，公开了一种纳米抗体Nb7及其编码基因、重组载体、重组菌株和菌剂以及它们的应用。所述纳米抗体Nb7包括：(1)氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的蛋白质；(2)氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示的蛋白质经改造获得的与改造前具有相同活性的衍生蛋白质。本发明提供的纳米抗体能够特异性结合PRRSV病毒，对PRRSV病毒具有良好的中和活性，这表明该纳米抗体能够单独或与其他抗体配合作为活性组分，发挥对PRRSV病毒的防治作用；进一步转化至益生菌中，实现基于益生菌递送纳米抗体进入猪的体内，从而预防和/或治疗猪蓝耳病的效果。

技术研发人员：黄和,王潘颖
受保护的技术使用者：南京工业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12