一种个性化定制的分子残留病检测方法与流程

本发明属于生物，具体涉及一种个性化定制的分子残留病检测方法。

背景技术：

1、mrd(molecule residual disease)，即分子残留病灶，是指癌症治疗后残留在体内的少量癌细胞团块。残留的癌细胞数量可能很少，不会引起任何体征或症状(但可能导致癌症复发)，甚至无法通过传统方法检测到，例如影像学和/或追踪血液中的肿瘤蛋白标志物。

2、经检索，中国专利文件申请号为：202111519375.5，公开了一种肺癌围手术期分子残留病灶基因检测panel及检测模型的构建方法，该发明通过整合肿瘤数据库和tcga、cosmic等著名肿瘤公共数据库，设计了一款覆盖肺癌驱动基因、靶向用药基因及热点突变的肺癌mrd基因检测panel，并开发了一套检测超低频基因突变预测模型。该发明以大样本量数据作为基础,聚焦肺癌驱动基因和热点突变，保证检测结果准确性；超高测序深度,保证了超低频检测限，超低频基因突变算法，提高突变检测精准度。该发明实施例证实,所述预测模型可以稳定检测0.02％的超低频突变。

3、但是，该方法仍存在以下缺陷：

4、该方法以大样本量数据作为基础制定一套检测超低频基因突变预测模型，该预测模型兼容性不佳，制作周期长，从而增加了一定的实验成本，因此我们需要提出一种个性化定制的分子残留病检测方法来解决上述存在的问题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种个性化定制的分子残留病检测方法，该方法可以大大控制实验系统的噪音信号，敏感度可达到样本水平十万分之三的突变水平，同时充分发挥多重pcr建库试剂的特点，制作周期和成本都得到很好的控制，以解决上述背景技术中提出的问题。

2、为实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

3、一种个性化定制的分子残留病检测方法，包括如下步骤：

4、s1、对肿瘤组织和对照血样本进行全外显子测序，并利用位点选择算法筛选肿瘤特异性的体细胞突变；

5、s2、针对筛选出的体细胞突变位点进行引物设计并合成，生产个性化定制的试剂；

6、s3、利用个性化定制试剂对治疗后的游离dna进行深度测序，通过生信分析得到目标位点的突变情况。

7、优选的，所述全外显子测序又称wes测试，wes测试要求h&e染色结果肿瘤含量大于20％，dna输入量5ng以上，肿瘤组织样本的平均覆盖深度200x以上，对照血样本的平均覆盖深度80x以上。

8、优选的，所述肿瘤特异性的体细胞突变是通过生信分析进行突变检测，通过qc指标和筛选条件筛选qc合格并且为体细胞突变的位点。

9、优选的，所述qc指标和筛选条件包括：肿瘤组织和对照血样本覆盖深度、肿瘤组织和对照血样本突变频率、肿瘤组织和对照血样本突变碱基质量分数、肿瘤组织和对照血样本突变序列比对质量分数、人群频率、突变类型、位点特殊位置信息。

10、优选的，所述位点特殊位置信息包括位点重复区域信息、位点高gc区域信息和位点同源区域信息。

11、优选的，步骤s2中在进行引物设计时，通过原创的位点选择算法筛选出病人的体细胞突变列表，并且设计出高质量的扩增子引物，根据扩增子引物生产出针对病人个性化的检测试剂盒。

12、优选的，所述位点选择算法可选择16-49个患者特异性的高质量位点进行引物设计，所述位点选择算法兼容全外显子测序，并且通过内部试验测试得出最有参数建议、肿瘤组织样本22g数据量和对照血样本5g数据量。

13、优选的，所述引物设计的要求是扩增子引物在染色体上具有唯一性，扩增子引物长度在50-100bp，gc含量在40％-60％，体细胞突变位点选择与引物设计阶段可自动化完成。

14、优选的，步骤s3中在深度测序时，需在术后或治疗后对病人进行定期采血监测，利用个性化定制的试剂对血液中的游离dna进行深度测序，经生信分析若突变体大于等于两个突变时，判定测试的血液检测结果为mrd阳性，若突变体小于两个突变时，则判定测试的血液检测结果为阴性。

15、优选的，在深度测序过程中，采血要求采集20ml血液提取33-66ng cfdna，个性化定制的试剂平均有毛病深度大于100000x。

16、本发明提出的一种个性化定制的分子残留病检测方法，与现有技术相比，具有以下优点：

17、1、本发明利用位点选择算法可以选择16-49个患者特异性的高质量位点进行引物设计，此位点选择算法对wes的测序深度具有很好的兼容性，并且通过内部试验测试得出最有参数建议，肿瘤组织样本22g数据量、对照血样本5g数据量即可，可降低wes的实验成本。

18、2、本发明的位点选择算法不但考虑了wes的结果质量，同时还考虑了扩增子引物设计的可行性与质量，从而减少引物设计过程的复杂度，整体位点选择和引物设计阶段可以自动化完成，2小时以内可以得到结果，大大缩减了时间消耗，满足患者治疗后第一次访视期的时限要求。

19、3、本发明可以对患者治疗效果进行评估，检测分子水平的肿瘤残留(mrd)，或长期监控肿瘤复发情况，深度测序结果中只关注患者个性化位点，从而降低了系统噪音对结果判读的影响，使检测灵敏性显著提高，实验结果显示肿瘤突变分子在十万分之三的水平下，检测的敏感性和特异性依然达到100％，敏感性远高于影像学等传统检测方法或其他分子检测技术，可以对肿瘤的复发进程提前预警。

技术特征：

1.一种个性化定制的分子残留病检测方法，其特征在于：包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种个性化定制的分子残留病检测方法，其特征在于：所述全外显子测序又称wes测试，wes测试要求h&e染色结果肿瘤含量大于20％，dna输入量5ng以上，肿瘤组织样本的平均覆盖深度200x以上，对照血样本的平均覆盖深度80x以上。

3.根据权利要求2所述的一种个性化定制的分子残留病检测方法，其特征在于：所述肿瘤特异性的体细胞突变是通过生信分析进行突变检测，通过qc指标和筛选条件筛选qc合格并且为体细胞突变的位点。

4.根据权利要求3所述的一种个性化定制的分子残留病检测方法，其特征在于：所述qc指标和筛选条件包括：肿瘤组织和对照血样本覆盖深度、肿瘤组织和对照血样本突变频率、肿瘤组织和对照血样本突变碱基质量分数、肿瘤组织和对照血样本突变序列比对质量分数、人群频率、突变类型、位点特殊位置信息。

5.根据权利要求4所述的一种个性化定制的分子残留病检测方法，其特征在于：所述位点特殊位置信息包括位点重复区域信息、位点高gc区域信息和位点同源区域信息。

6.根据权利要求5所述的一种个性化定制的分子残留病检测方法，其特征在于：步骤s2中在进行引物设计时，通过原创的位点选择算法筛选出病人的体细胞突变列表，并且设计出高质量的扩增子引物，根据扩增子引物生产出针对病人个性化的检测试剂盒。

7.根据权利要求6所述的一种个性化定制的分子残留病检测方法，其特征在于：所述位点选择算法可选择16-49个患者特异性的高质量位点进行引物设计，所述位点选择算法兼容全外显子测序，并且通过内部试验测试得出最有参数建议、肿瘤组织样本22g数据量和对照血样本5g数据量。

8.根据权利要求7所述的一种个性化定制的分子残留病检测方法，其特征在于：所述引物设计的要求是扩增子引物在染色体上具有唯一性，扩增子引物长度在50-100bp，gc含量在40％-60％，体细胞突变位点选择与引物设计阶段可自动化完成。

9.根据权利要求1所述的一种个性化定制的分子残留病检测方法，其特征在于：步骤s3中在深度测序时，需在术后或治疗后对病人进行定期采血监测，利用个性化定制的试剂对血液中的游离dna进行深度测序，经生信分析若突变体大于等于两个突变时，判定测试的血液检测结果为mrd阳性，若突变体小于两个突变时，则判定测试的血液检测结果为阴性。

10.根据权利要求9所述的一种个性化定制的分子残留病检测方法，其特征在于：在深度测序过程中，采血要求采集20ml血液提取33-66ng cfdna，个性化定制的试剂平均有毛病深度大于100000x。

技术总结
本发明公开了一种个性化定制的分子残留病检测方法，该方法先对肿瘤组织和对照血样本进行全外显子测序，并利用位点选择算法筛选肿瘤特异性的体细胞突变，再针对筛选出的体细胞突变位点进行引物设计并合成，生产个性化定制的试剂，最后利用个性化定制试剂对治疗后的游离DNA进行深度测序，通过生信分析得到目标位点的突变情况，通过该方法可以对患者治疗效果进行评估，且深度测序结果中只关注患者个性化位点，从而降低了系统噪音对结果判读的影响，使检测灵敏性显著提高，利用位点选择算法，可以选择16‑49个患者特异性的高质量位点进行引物设计，此位点选择算法对WES的测序深度具有很好的兼容性，可降低WES的实验成本。

技术研发人员：宋钢,王朝晖,王强
受保护的技术使用者：上海真固生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13