一种同时检测罗非鱼中五种食源性致病菌的多重PCR引物组及检测方法

本发明属于分子生物学，具体涉及一种同时检测罗非鱼中五种食源性致病菌的多重pcr引物组及检测方法。

背景技术：

1、罗非鱼是我国出口的最主要的水产品之一，作为世界上最大的罗非鱼出口国，我国每年的罗非鱼产量占全世界产量的50％以上，罗非鱼产品安全在我国食品安全中占有不可忽视的地位。食源性致病菌目前已成为危害罗非鱼食品安全，影响人类身体健康的一个关键问题，准确、快速检测罗非鱼中的食源性致病菌是控制食源性疾病暴发的必要手段。目前罗非鱼食源性致病菌的检测主要是针对无乳链球菌，对其他致病菌的检测相对较少。然而，有研究表明罗非鱼在产品加工、包装、运输、储藏、销售等环节会因接触到环境中的多种病原菌而污染。黎小正等对广西省罗非鱼食源性致病菌污染情况的调查结果显示无论是采自养殖场的罗非鱼样品还是市售罗非鱼样品,均能检测出无乳链球菌(streptococcusagalactiae)、嗜水气单胞菌(aeromonashydrophila)、沙门菌(salmonella)和大肠杆菌(escherichia coli)等多种食源性致病菌。李来好等对采自广东省不同区域养殖场的罗非鱼样品检测结果显示，大肠杆菌、霍乱弧菌(vibrio cholera)和嗜水气单胞菌检出率较高，其次为阪崎肠杆菌(enterobactersakazakii)、副溶血弧菌(vibrio parahaemolyticus)等。因此，亟需建立一种快速、灵敏和特异性强的致病菌检测技术以预防和控制罗非鱼水产品食源性疾病的发生。

2、目前，水生动物致病菌的检测通常采用常规培养分离和生化鉴定等技术。这种方法检测周期长、操作复杂，且检测单一，很难适应现代化食品安全快速检测的需要。尽管一些学者已经开发出可同时检测多种致病菌的多重pcr检测方法。例如，胡宗云等建立了可同时检测3种淡水鱼致病菌的多重pcr检测方法；蒋蔚等建立针对水产品中霍乱弧菌、副溶血性弧菌和单增李斯特菌(listeria monocytogenes)的三重pcr检测方法；王璐等根据细胞兴奋性肠毒素基因和气溶素结构基因，建立了可快速检测嗜水气单细胞菌双重pcr方法。但这些方法仅能检测1～3种致病菌，检测范围依然狭小，检测效率较低，且不适用于罗非鱼多种食源性致病菌的检测。

技术实现思路

1、为了克服现有技术中的问题，实现对罗非鱼常见食源性致病菌的快速、灵敏、高通量检测，本研究以无乳链球菌ef-tμ基因、嗜水气单胞菌ompa基因、沙门菌inva基因、霍乱弧菌ompw基因、大肠杆菌phoa基因作为目标基因，建立五重pcr检测体系，为罗非鱼常见食源性致病菌的快速高效检测提供了重要的技术手段。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种同时检测罗非鱼中五种食源性致病菌的多重pcr引物组，其使用引物组可同时检测的五种细菌分别为无乳链球菌、嗜水气单胞菌、霍乱弧菌、大肠杆菌和沙门菌，所述引物组为针对无乳链球菌ef-tμ基因、嗜水气单胞菌ompa基因、沙门菌inva基因、霍乱弧菌ompw基因、大肠杆菌phoa基因设计的引物组。

3、优选的，所述引物组包括序列如seq id no：1、seq id no：3、seq id no：5、seq idno：7和seq id no：9所示的上游引物以及序列如seq id no：2、seq id no：4、seq id no：6、seq id no：8和seq id no：10所示的下游引物。

4、优选的，所述引物组中，

5、序列seq id no：1和seq id no：2针对无乳链球菌ef-tμ基因；

6、或序列seq id no：3和seq id no：4针对嗜水气单胞菌ompa基因；

7、或序列seq id no：5和seq id no：6针对沙门菌inva基因；

8、或序列seq id no：7和seq id no：8针对霍乱弧菌ompw基因；

9、或序列seq id no：9和seq id no：10针对大肠杆菌phoa基因。

10、作为本发明的另一方面，本发明提供一种同时检测罗非鱼中五种食源性致病菌的多重pcr检测方法，其包括以下步骤，

11、s1提取待测样品的总dna；

12、s2以提取的基因组dna为模板，利用引物组进行多重pcr扩增反应；

13、s3扩增产物的判定：取pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；

14、若pcr产物片段大小含有150bp、349bp、474bp、588bp和830bp的一种或几种，则表示待测样品中分别含有无乳链球菌、嗜水气单胞菌、大肠杆菌、霍乱弧菌和沙门菌中的一种或几种。

15、优选的，所述步骤s2中的多重pcr扩增反应体系为：模板5μl，引物组中各对引物浓度为0.8～1.4μmol/l，2×mix 20μl，ddh2o补足40μl；

16、优选的，所述步骤s2中的多重pcr扩增反应条件为：95℃预变性3min，95℃变性30s，50.9～57.1℃退火30s，72℃延伸30s，运行32～36个循环，72℃充分延伸10min，扩增产物4℃保存。

17、优选的，所述步骤s2中的多重pcr扩增反应条件为：95℃预变性3min，95℃变性30s，52.9℃退火30s，72℃延伸30s，运行32个循环，72℃充分延伸10min，扩增产物4℃保存。

18、本发明的有益效果：

19、本研究建立的多重pcr方法可对罗非鱼水产品中的无乳链球菌、嗜水气单胞菌、霍乱弧菌、大肠杆菌和沙门菌等5种常见食源性致病菌进行快速检测，且具有良好的特异性和灵敏性。整个过程包括总dna提取、pcr扩增和电泳分析，可在16小时内完成，符合水产品大批量检测的需求，具有广泛的应用前景。

技术特征：

1.一种同时检测罗非鱼中五种食源性致病菌的多重pcr引物组，其特征在于：使用引物组可同时检测的五种细菌分别为无乳链球菌、嗜水气单胞菌、霍乱弧菌、大肠杆菌和沙门菌，所述引物组为针对无乳链球菌ef-tμ基因、嗜水气单胞菌ompa基因、沙门菌inva基因、霍乱弧菌ompw基因、大肠杆菌phoa基因设计的引物组；

2.如权利要求1所述的同时检测罗非鱼中五种食源性致病菌的多重pcr引物组，其特征在于：所述引物组中，

3.用权利要求1-2所述的引物组同时检测罗非鱼中五种食源性致病菌的多重pcr检测方法，其特征在于：包括以下步骤，

4.根据权利要求3所述的多重pcr检测方法，其特征在于：所述步骤s2中的多重pcr扩增反应体系为：模板5 μl，引物组中各对引物浓度为0.8~1.4μmol/l，2×mix 20 μl，ddh2o补足40 μl。

5.根据权利要求3所述的多重pcr检测方法，其特征在于：所述步骤s2中的多重pcr扩增反应条件为：95℃预变性3 min，95℃变性30 s，50.9~57.1℃退火30 s，72℃延伸30 s，运行32-36个循环，72℃充分延伸10 min，扩增产物4℃保存。

6.根据权利要求5所述的多重pcr检测方法，其特征在于：所述步骤s2中的多重pcr扩增反应条件为：95℃预变性3 min，95℃变性30 s，52.9℃退火30 s，72℃延伸30 s，运行32个循环，72℃充分延伸10 min，扩增产物4℃保存。

技术总结
本申请公开了一种可同时检测罗非鱼中五种食源性致病菌的多重PCR引物组及检测方法。该多重PCR检测引物由特异性地针对无乳链球菌ef‑tμ基因、嗜水气单胞菌ompA基因、沙门菌invA基因、霍乱弧菌ompW基因、大肠杆菌phoA基因的引物对组成，其序列表2所示。基于上述引物对，本发明优化了多重PCR检测体系和反应条件，建立了五重PCR检测方法，并对多重PCR体系的特异性、灵敏度以及人工模拟样品检测进行评价，灵敏度均在0.4 ng/μL以上，检出限可达到10<supgt;2</supgt; CFU/mL。本方法的建立为罗非鱼常见食源性致病菌的快速检测提供了重要的技术手段，也为罗非鱼细菌病的防控奠定了基础。

技术研发人员：董雨豪,杨亚琨,刘永杰
受保护的技术使用者：南京农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12