核糖体结合序列的筛选及其在肌醇重组菌构建中的应用的制作方法

本发明属于生物，特别涉及一种肌醇代谢途径的基因调控元件和肌醇生产菌种构建。

背景技术：

1、肌醇是合成鲨肌醇、糖醛酸的前体，广泛分布在动物和植物体内，是动物和微生物的生长因子。肌醇有多个顺反异构体，天然存在的异构体为顺-1,2,3,5-反-4,6-环己六醇。有几种不同途径生产肌醇。一、在酸/碱性条件下水解肌醇六磷酸生产肌醇，缺点是酸/碱容易造成环境污染。二、以米糠、饼粕为原料生产肌醇，从米糠或麸皮中提取植酸钙，经过加压水解生产肌醇，缺点是生产效率低，生产设备要求高，易造成环境污染。三、体外四种酶级联反应生产肌醇，缺点是制备酶的成本高。首先，淀粉经过α-葡聚糖(或麦芽糖糊精)磷酸化酶和磷酸葡萄糖变位酶催化得到葡萄糖-6-磷酸(g-6-p)，再经过肌醇-3-磷酸合酶(ips)、肌醇单磷酸酶(imp)级联催化得到肌醇，缺点是酶不稳定，酶的生产成本高。四、体外三酶催化生产肌醇，三酶分别是多聚磷酸葡萄糖激酶(ppgk)，肌醇-3-磷酸合酶和肌醇单磷酸酶，缺点是产物分离提纯复杂，酶的生产成本高，酶不稳定。五、发酵法生成肌醇，葡萄糖作为起始原料，被磷酸化生成葡萄糖-6-磷酸，经过肌醇-3-磷酸合酶的环化和异构化作用生成肌醇-3-磷酸，再经过肌醇单磷酸化酶催化生成肌醇，主要挑战是在菌体生长和产物生成之间平衡葡萄糖-6-磷酸的代谢流。

2、根据文献和专利报道，发酵法生产肌醇主要是过表达ips(编码肌醇-1-磷酸合酶)、imp(编码肌醇单磷酸酶)和glpk(编码甘油激酶)，敲除竞争性代谢途径得到重组菌株。但是重组菌株中代谢通路经过改造后，改变了天然的代谢通路，需要对过表达的基因进行代谢调控，以适应新的代谢通路体系，从而提高肌醇生产效率，否则会导致转化率或产量偏低。例如在重组菌株发酵生产肌醇过程中，ips表达量的不足会限制产物的合成，常用的基因表达量检测方法无法满足高通量筛选，因此提供高效的高通量筛选方法以便于协调重组菌改造过程中基因表达的调节，同时得到适于肌醇代谢调控的基因元件，构建协调性强的菌体代谢通路，得到转化效率提高的菌株，是肌醇发酵生产亟待解决的问题。

技术实现思路

1、本发明从调控基因表达的核糖体结合序列(rbs)入手，构建了核糖体结合序列的筛选库，得到了能够调控ips和imp基因表达的核糖体结合序列，构建了ips和imp基因的表达盒，应用于构建肌醇重组菌株，用于肌醇的发酵生产。

2、本发明的一个方面：构建了rbs筛选库，首先构建用于蓝白斑筛选的质粒，目标基因ips与laczα通过设计的核苷酸碱基连接，翻译后的融合蛋白(ips-laczα)与基因组上laczω片段结合可用于显色筛选。该质粒表达ips(编码肌醇-1-磷酸合酶)、imp(编码肌醇单磷酸酶)和glpk(编码甘油激酶)，将上述基因置于rbs调控之下。rbs库的建立是通过含有八个简并碱基的引物，以上述表达质粒为模板，通过pcr扩增进行建库，以敲除laczα片段的宿主菌作为蓝白斑筛选的底盘菌株，将构建得到的rbs区域库转化到底盘菌株中，涂布至含有iptg和x-gal的平板上进行筛选。

3、本发明的另一个方面：构建了肌醇发酵的底盘菌株，该菌株的构建过程中进行了以下基因操作：

4、1)敲除了编码葡萄糖磷酸异构酶的pgi；

5、2)敲除了编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的zwf；

6、3)敲除了编码丙酮酸激酶的pykf或pyka；

7、4)转入了ips、imp、glpk基因。

8、本领域技术人员能够理解，可以用现有技术已知的方式进行基因敲除，使得所述酶的活性被降低或失活。所述的敲除操作针对的是出发微生物内源性的酶基因，使得微生物的上述内源性酶活性降低或失活。

9、本领域技术人员能够理解，丙酮酸激酶的国际酶学编号为ec2.7.1.40，又称磷酸丙酮酸激酶和丙酮酸磷酸转移酶。细菌中通常有两种丙酮酸激酶，即i型pykf丙酮酸激酶(pykf)和ii型丙酮酸激酶(pyka)。而且该酶在同一有机体中存在多种同工酶，本领域技术人员能够明了，对其任一同工酶的基因敲除都会影响丙酮酸的进一步代谢。

10、本领域技术人员能够理解敲除pgi，zwf和pykf基因可以增加肌醇的积累，其同工酶基因的敲除将会具有相同或相似的效果。

11、本发明的另一个方面：将筛选到的rbs用于ips和imp的调控，并构建在肌醇发酵的生产菌株中，获得肌醇高产菌株。

12、基因可以单独表达也可以串联表达，在本申请的一个实施例中串联表达了ips基因、imp基因和glpk基因。ips基因与imp基因之间采用序列3所示的核苷酸序列进行连接。ips与laczα之间采用连接肽连接进行融合表达，连接肽的核苷酸序列如序列5所示，对应的氨基酸序列如序列4所示。

13、本发明过表达的基因可以以质粒的形式存在也可以整合到基因组中。可以对基因组上副产物相关一个或多个基因进行替换。

14、本发明在目标蛋白后通过短肽连接laczα，因此可以通过蓝白斑筛选策略对靶基因表达量进行较准确的筛选。同时又将底盘菌株构建为△laczα基因型，直接在底盘菌株中进行建库筛选，避免了基因元件筛选过程中与工业菌株构建后基因元件表现一致性差的问题。

15、本申请的实施例中公开了一种筛选基因核糖体结合序列的方法：包括构建缺失laczα基因的菌株，建立核糖体结合序列库，将核糖体序列筛选库转入缺失laczα基因的菌株，转化子接种到含有x-gal的培养基中，根据颜色变化进行核糖体结合序列的筛序，其特征在于核糖体结合序列库是将核糖体结合序列与目的基因进行重组构建目的基因表达盒，并将目的基因与lacz基因融合，优选的核糖体结合序列的融合采用pcr方法，更优选的目的基因为肌醇生产关键基因肌醇-1-磷酸合酶基因(ips)和/或肌醇单磷酸酶基因(imp)。

16、依赖蓝白斑筛选策略优化rbs序列：蓝白斑筛选的原理是laczα和laczω两个无催化活性的片段，靠近结合成有β-半乳糖苷酶活性的酶，能够催化显色剂x-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚半乳糖苷)分解得到蓝色物质(如图5所示)。ips可溶性表达优化，在此将laczα与目标蛋白融合表达，根据显色结果判断ips蛋白的表达量。

17、在一个实施例中，本申请使用rbs区域的几种正向突变，在经过验证后获得了一株肌醇高产菌株oh-mi4。于2022年11月14日提交专利保藏，保藏号为cctcc no:m20221796，分类命名为大肠埃希氏菌(escherichia coli)oh-mi4，保藏单位是中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国湖北武汉，武汉大学。经过发酵验证，使用含该序列的质粒明显提高了肌醇的产量，菌株oh-mi4经过96h补料发酵后产量达到53g/l。

技术特征：

1.一种核糖体结合序列(rbs)，其含有下述核苷酸序列：

2.一种含有权利要求1所述核糖体结合序列的表达盒。

3.权利要求1所述核糖体结合序列在构建肌醇生产菌中的应用。

4.一种用权利要求1所述核糖体结合序列构建肌醇生产菌的方法，其特征在于，肌醇-1-磷酸合酶基因(ips)、肌醇单磷酸酶基因(imp)和甘油激酶基因(glpk)的核糖体结合序列含有下述核苷酸序列：m1-rbs：tcgtcgag；m2-rbs：gcttaagg；m3-rbs：gcgtatcc；m4-rbs：caggacac；m5-rbs：gcagatgc；m6-rbs：tttcacac；m7-rbs：tcattcga；优选核糖体结合序列含有m4-rbs所示的核苷酸序列。

5.根据权利要求4所述的构建肌醇生产菌的方法，ips、imp和glpk基因为串联表达。

6.根据权利要求4所述的构建肌醇生产菌的方法，ips、imp和glpk基因为串联表达的顺序为ips，imp，glpk。

7.根据权利要求4所述的构建肌醇生产菌的方法，其特征在于，还包括敲除选自以下基因组中的一个或多个，所述基因包括葡萄糖磷酸异构酶基因，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因和丙酮酸激酶基因。

8.根据权利要求4-7任一项所述方法得到的肌醇生产重组菌株。

9.根据权利要求8所述的肌醇生产重组菌株，其特征在于保藏编号为cctcc no:m20221796。

10.一种筛选基因核糖体结合序列的方法：包括构建缺失laczα基因的菌株，建立核糖体结合序列库，将核糖体序列筛选库转入缺失laczα基因的菌株，转化子接种到含有x-gal的培养基中，根据颜色变化进行核糖体结合序列的筛选，其特征在于糖体结合序列库是将核糖体结合序列与目的基因进行重组构建目的基因表达盒，并将目的基因与laczα基因融合，优选的核糖体结合序列的融合采用pcr方法，更优选的目的基因为肌醇生产关键基因肌醇-1-磷酸合酶基因(ips)和/或肌醇单磷酸酶基因(imp)。

技术总结
本发明通过构建RBS筛选库和高通量筛选方法，得到协调肌醇代谢通路关键基因的RBS序列，并用其构建了发酵生产肌醇的重组菌株。使得肌醇发酵菌株的产量获得极大提升，对肌醇生产具有重要的经济价值和科学研究价值。

技术研发人员：姚臻豪,郑华宝
受保护的技术使用者：杭州欧合生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13