一种血红素的制备方法和应用

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1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种血红素的制备方法和应用。


背景技术：

2.血红素是一种广泛存在于动植物和微生物中的含铁卟啉衍生物，由原卟啉和1个二价铁离子构成，具有多种生理功能，参与机体铁平衡调节、氧气运输、电子传递等重要生命过程。血红素在食品行业常被用作安全无害的着色剂，替代人工合成色素，既能维持食品色泽，又能强化营养。基于这一特点，血红素在人造肉生产中的应用前景巨大，通过添加外源血红素可以使人造肉具有更真实的肉色。在医药行业，血红素也被广泛关注。它可以用于生产抗肝功能亢进、抗炎症和抗肿瘤的药物；亚铁血红素可直接被人体吸收，用作补血剂。目前血红素主要通过化学法合成，或从植物组织和动物血液中分离，但成本高、纯度低、副产物多。随着血红素应用领域的扩展，仅依靠化学合成和从动植物中提取显然不能满足市场需求，因此，利用微生物生产血红素已被认为是极具可行性的替代方法。当前，血红素的微生物合成主要采用基因工程技术利用大肠杆菌作为宿主菌生产，谷氨酸棒杆菌、黑曲霉、枯草芽孢杆菌也可作为生产血红素的潜力宿主菌。


技术实现要素：

3.本发明的第一个目的是提供一种血红素的制备方法。
4.本发明的血红素的制备方法，所述的血红素是从丙酸杆菌(corallicola sp.)scsio 13291cgmcc no.14538的发酵培养物制备得到的。
5.所述的制备丙酸杆菌scsio 13291的发酵培养物是以海水胰酪大豆胨液体培养基为发酵培养基进行发酵培养获得发酵培养物。
6.优选，所述的海水胰酪大豆胨液体培养基为：每升含有胰蛋白胨17g、大豆蛋白胨3.0g、葡萄糖2.5g、氯化钠5.0g、k2hpo
4 2.5g、余量为陈海水，ph7.3。海水胰酪大豆胨琼脂培养基是在海水胰酪大豆胨液体培养基的基础上加入琼脂，15g/l。
7.优选，所述的发酵培养物是菌体。
8.优选，将丙酸杆菌scsio 13291接种于海水胰酪大豆胨琼脂培养基上活化，之后挑取单菌落接种至含有海水胰酪大豆胨液体培养基的锥形瓶中，置于25℃摇床上，以160转/分钟振荡培养3天后获得发酵培养物，以12000转/分钟的转速在4℃条件下离心5分钟分离发酵培养物中的上清液和菌体；去掉上清液后，用无菌去离子水重悬并清洗菌体，以12000转/分钟的转速在4℃条件下离心5分钟后弃上清，获得菌体。
9.本发明的第二个目的是提供丙酸杆菌scsio 13291在制备血红素中的应用。
10.优选，所述的丙酸杆菌scsio 13291是丙酸杆菌scsio 13291的菌体。
11.本发明从丙酸杆菌(corallicola sp.)scsio 13291制备出血红素，因此可将它用于血红素相关药物、食品中的应用。
12.本发明的丙酸杆菌(corallicola sp.)scsio 13291，该菌于2017年8月18日保藏
于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：cgmcc no.14538。该菌株公开于专利cn201711305261.4，发明名称：一种丙酸杆菌及其在生产叶酸和烟酸中的应用中。
附图说明：
13.图1是血红素浓度标准曲线。
具体实施方式：
14.以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
15.实施例1：
16.将丙酸杆菌(corallicola sp.)scsio 13291从30％(w/v)甘油超低温保藏管接种于海水胰酪大豆胨琼脂培养基(培养基的配方为：每升含有胰蛋白胨17g、大豆蛋白胨3.0g、葡萄糖2.5g、氯化钠5.0g、k2hpo
4 2.5g、琼脂粉15g，余量为gf/f玻璃微纤维滤膜过滤的陈海水，其配置方法是将各成分混合均匀，调ph7.3，灭菌制得)上活化，之后挑取单菌落接种至锥形瓶中，每瓶含有50毫升海水胰酪大豆胨液体培养基(培养基的配方为：每升含有胰蛋白胨17g、大豆蛋白胨3.0g、葡萄糖2.5g、氯化钠5.0g、k2hpo
4 2.5g，余量为gf/f玻璃微纤维滤膜过滤的陈海水，ph7.3)。置于25℃摇床上，以160转/分钟振荡培养3天后获得发酵培养物。以12000转/分钟的转速在4℃条件下离心5分钟分离发酵培养物中的上清液和菌体。去掉上清液后，用无菌去离子水重悬并清洗菌体，以12000转/分钟的转速在4℃条件下离心5分钟后弃上清，称量并记录菌体湿重。
17.用500微升20毫摩尔/升草酸溶液重悬0.33
±
0.03克菌体，然后转移至1.5毫升琥珀色离心管，轻轻混匀后在4℃静置16小时。之后在离心管中加入500微升2摩尔/升的草酸溶液混匀，再取500微升样品转移至另一个1.5毫升琥珀色离心管中，在95℃水浴锅中加热30分钟反应，用于卟啉和血红素总浓度荧光值的检测，另500微升样品则置于常温用于卟啉浓度荧光值的检测。
18.样品冷却至室温后，用12000转/分钟的转速离心5分钟，取200微升上清液于黑色透明底的96孔板中进行荧光值测定，检测条件为激发波长为400nm，发射波长为620nm。计算上述两组的荧光值差值，差值即为待测血红素浓度对应的荧光值。
19.用0.25％(w/v)的na2co3溶液配置不同浓度的氯化高铁血红素标准样品，将不同浓度的标准样品和2摩尔/升草酸溶液以1:1等体积混合，之后置于95℃水浴锅加热30分钟反应。待标准样品冷却至室温后，取200微升上清液于黑色透明底的96孔板中进行荧光值测定，检测条件为激发波长为400nm，发射波长为620nm。根据荧光值和血红素浓度绘制标准曲线，以荧光值为纵坐标，血红素浓度为横坐标，绘制标准曲线如图1。
20.将上述实验样品检测获得的荧光值差值作为y值，代入公式y＝1643.9x+2229，计算x值，即为实验样品中的血红素浓度。再根据用于血红素提取的菌体湿重，计算每克湿菌体的血红素含量，结果为8.46
±
1.43微克/克湿菌体。


技术特征：
1.一种血红素的制备方法，其特征在于，所述的血红素是从丙酸杆菌(corallicola sp.)scsio13291cgmcc no.14538的发酵培养物制备得到的。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的丙酸杆菌scsio 13291的发酵培养物是以海水胰酪大豆胨液体培养基为发酵培养基，丙酸杆菌scsio 13291进行发酵培养获得发酵培养物。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的海水胰酪大豆胨液体培养基为：每升含有胰蛋白胨17g、大豆蛋白胨3.0g、葡萄糖2.5g、氯化钠5.0g、k2hpo
4 2.5g、余量为陈海水，ph7.3。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的发酵培养物是菌体。5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，将丙酸杆菌scsio 13291接种于海水胰酪大豆胨琼脂培养基上活化，之后挑取单菌落接种至含有海水胰酪大豆胨液体培养基的锥形瓶中，置于25℃摇床上，以160转/分钟振荡培养3天后获得发酵培养物，以12000转/分钟的转速在4℃条件下离心5分钟分离发酵培养物中的上清液和菌体；去掉上清液后，用无菌去离子水重悬并清洗菌体，以12000转/分钟的转速在4℃条件下离心5分钟后弃上清，获得菌体，所述的海水胰酪大豆胨琼脂培养基是在海水胰酪大豆胨液体培养基的基础上加入琼脂。6.丙酸杆菌scsio 13291在制备血红素中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的丙酸杆菌scsio 13291是丙酸杆菌scsio 13291的菌体。

技术总结
本发明公开了一种血红素的制备方法和应用。所述的血红素是从丙酸杆菌(Corallicolasp.)SCSIO 13291CGMCC No.14538的发酵培养物制备得到的。本发明从丙酸杆菌(Corallicolasp.)SCSIO 13291制备出血红素，因此可将它用于血红素相关药物、食品中的应用。用。用。


技术研发人员：李洁 张偲
受保护的技术使用者：中国科学院南海海洋研究所
技术研发日：2022.11.30
技术公布日：2023/3/7