一种细胞穿透抗菌肽PW2及其制备方法和应用

本发明属于农业畜牧兽医应用领域，具体涉及一种细胞穿透抗菌肽pw2及其制备方法和应用。

背景技术：

1、细胞内感染是慢性疾病的代表性杀手，病原体潜入细胞内可逃避机体免疫防御和清除的一系列作用，通常对宿主细胞毒性较低，以保证其长期隐匿于细胞内，因此在机体内不断生长和繁殖，并可在畜禽动物之间水平传播，在适当时机或当畜禽免疫力减弱时便发作，严重时可危及生命。细胞内感染病原体对畜牧生产造成了严重的危害，例如，无乳链球菌侵袭奶牛乳腺细胞后会造成奶牛泌乳量下降、乳品质降低等危害。猪伤寒沙门氏菌侵袭断奶仔猪肠道上皮细胞也会导致仔猪免疫力下降、降低采食量和生长性能。因此，解决细胞内感染在畜牧兽医领域具有极为广阔的市场应用前景。

2、虽然青霉素在目前是一种极为有效的抗感染药物，但是青霉素无法转导进入细胞内部来清除胞内细菌。此外，随着农业农村部194号公告的颁布，饲料中已全面禁用饲用抗生素。因此，迫切寻找一种能够清除胞内细菌的生物分子。抗菌肽是生物体内广泛存在的具有抗菌活性的小分子多肽，对真菌、病毒、寄生虫和癌细胞也具有杀伤作用。现需要一种能够清除细胞内细菌的高效细胞穿透抗菌肽，为饲用型抗菌肽的研发提供理论基础和技术支持。

技术实现思路

1、基于以上问题，本发明的目的在于公开一种细胞穿透抗菌肽pw2，该抗菌肽pw2是一种衍生自hiv的细胞穿透肽tat和抗菌肽杂合形成的细胞穿透抗菌肽，其目的是能够穿透哺乳动物细胞并清除胞内病原体，克服青霉素无法解决的胞内感染的难题，使其拥有成为抗生素替代物的潜力。

2、本发明的目的是这样实现的：一种细胞穿透抗菌肽pw2，其氨基酸序列如seqidno.1所示，其c端酰胺化。

3、本发明的另一目的是提供如上所述的一种细胞穿透抗菌肽pw2的制备方法，如下：通过成对trp-trp基序与pro排列来促进细胞穿透抗菌肽的抗菌活性，其序列为pwwppwwp；衍生自hiv的细胞穿透肽tat的氨基酸序列为rkkrrqrrr；两者通过三甘氨酸连接体ggg相连；采用固相化学合成法得到肽树脂，将得到的肽树脂经过tfa切割后，得到多肽，其序列如seq id no.1所示，经过反相高效液相色谱纯化和质谱鉴定后，即完成该多肽的制备；再经过抗菌活性检测、溶血活性的测定、细胞内杀菌能力的测定，最后命名为细胞穿透抗菌肽pw2。

4、本发明的另一目的是提供如上所述的一种细胞穿透抗菌肽pw2在制备治疗革兰氏阴性菌和/或革兰氏阳性菌感染性的疾病的药物中的应用。

5、进一步的，如上所述的应用，所述的抗菌肽pw2能够杀灭细胞内的金黄色葡萄球菌。

6、进一步的，如上所述的应用，所述的抗菌肽pw2能够杀灭小鼠巨噬细胞raw264.7内的金黄色葡萄球菌。

7、本发明的有益效果及优点如下：本发明杂合了细胞穿透肽tat和抗菌肽，对形成的细胞穿透抗菌肽pw2进行生物学活性检测，发现其不但对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌等6种菌种有高效的抑制作用，而且具备较低的溶血毒性，该细胞穿透抗菌肽在128μm的浓度下仅造成2.16％的红细胞溶血。另外，该细胞穿透抗菌肽具有杀灭小鼠巨噬细胞raw264.7内金黄色葡萄球菌的能力，而青霉素无法杀灭胞内细菌，其已具备成为抗生素替代物和饲用型细胞穿透抗菌肽的发展潜力。

技术特征：

1.一种细胞穿透抗菌肽pw2，其特征在于，氨基酸序列如seq id no.1所示,其c端酰胺化。

2.根据权利要求1所述的一种细胞穿透抗菌肽pw2的制备方法，其特征在于，方法如下：通过成对trp-trp基序与pro排列来促进细胞穿透抗菌肽的抗菌活性，其序列为pwwppwwp；衍生自hiv的细胞穿透肽tat的氨基酸序列为rkkrrqrrr；两者通过三甘氨酸连接体ggg相连；采用固相化学合成法得到肽树脂，将得到的肽树脂经过tfa切割后，得到多肽，其序列如seq id no.1所示，经过反相高效液相色谱纯化和质谱鉴定后，即完成该多肽的制备；再经过抗菌活性检测、溶血活性的测定、细胞内杀菌能力的测定，最后命名为细胞穿透抗菌肽pw2。

3.根据权利要求1所述的一种细胞穿透抗菌肽pw2在制备治疗革兰氏阴性菌和/或革兰氏阳性菌感染性的疾病的药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的抗菌肽pw2能够杀灭细胞内的金黄色葡萄球菌。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的抗菌肽pw2能够杀灭小鼠巨噬细胞raw264.7内的金黄色葡萄球菌。

技术总结
本发明提供一种细胞穿透抗菌肽PW2及其制备方法和应用，属于农业畜牧兽医应用领域，细胞穿透抗菌肽PW2的序列如SEQ ID No.1所示；合成方法示意如下：通过成对Trp‑Trp基序与Pro排列来促进细胞穿透抗菌肽的抗菌活性，其序列为PWWPPWWP；衍生自HIV的细胞穿透肽TAT的氨基酸序列为RKKRRQRRR；两者通过三甘氨酸连接体GGG相连，并命名为PW2。本发明的细胞穿透抗菌肽PW2对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌具有较高的抑菌活性，能够杀灭小鼠巨噬细胞RAW264.7内的金黄色葡萄球菌，使其具备成为饲用抗生素替代物的潜力。

技术研发人员：董娜,方禹鑫,赵璐,隋明瑞,姜乾智
受保护的技术使用者：东北农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13