一种用于检测新冠病毒突变株的引物对、探针及试剂盒的制作方法

本发明属于核酸检测，特别涉及一种用于检测新冠病毒突变株的引物对、探针及试剂盒。

背景技术：

1、新型冠状病毒由最先的原始病毒至今已发展产生多种突变毒株，其中以delta突变株和omicron突变株最为典型。在现今的疫情防控需求下，不仅仅要求对样品中是否包含新冠病毒进行检测，还需要对新冠病毒进行分型和鉴定。然而，采用全基因组测序的方法进行新冠病毒分型存在着成本较高，较为繁琐的不足，而现有的核酸检测试剂盒又很难一次性区分和鉴定多种新冠病毒突变株。基于此，本发明希望针对delta突变株和omicron突变株上的多个检测基因和位于s基因上的突变位点进行引物和探针的设计，并将其进行组合使用，从而构建得到一种用于检测新冠病毒突变株且检测效果良好的核酸检测试剂盒产品。

技术实现思路

1、本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种用于检测新冠病毒突变株的引物对、探针及试剂盒。采用上述引物对和探针，可一次性实现对delta、omicron ba.1、omicron ba.1.1、omicron ba.2、omicron ba.3在内的多种新冠病毒突变株的分型，且检测特异性和检测灵敏度良好。

2、本发明提供了一种用于检测新冠病毒突变株的引物对，包括：

3、分别检测orf1ab基因、n基因、p681r位点、d405n位点、r346k位点、p681h位点、6970del位点和t547k位点的引物对，其核苷酸序列依次如seq id no:1-16所示。

4、本发明还提供了一种用于检测新冠病毒突变株的探针，包括：

5、分别检测orf1ab基因、n基因、p681r位点、d405n位点、r346k位点、p681h位点、6970del位点和t547k位点的探针，其核苷酸序列依次如seq id no:17-24所示。

6、优选地，所述检测orf1ab基因、n基因的探针为ddq探针，所述检测p681r位点、d405n位点、r346k位点、p681h位点、6970del位点、t547k的探针为dq探针。

7、dq探针用于检测单碱基突变，能够提高探针的tm值；而ddq是一种双淬灭探针，可以降低探针的背景。采用上述探针能够改善常规taqman探针特异性不足的问题，从而有效提高检测的准确性。

8、本发明还提供了一种用于检测新冠病毒突变株的试剂盒，包括：预混试剂、上述引物对和上述探针；所述预混试剂包括dntp、taq酶、mmlv反转录酶、冻干保护剂、rt-pcr缓冲液和水。

9、优选地，所述冻干保护剂包含甘氨酸和海藻糖。

10、优选地，所述试剂盒还包括检测内参基因rnp的引物对和探针；所述检测内参基因rnp的引物对的核苷酸序列如seq id no:25-26所示，所述检测内参基因rnp的探针的核苷酸序列如seq id no:27所示。

11、本发明还提供了上述试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

12、将检测orf1ab基因、n基因、内参基因rnp的引物对、探针与预混试剂混合，经冻干，得到冻干组分1；

13、将检测p681r位点、d405n位点的引物对、探针与预混试剂混合，经冻干，得到冻干组分2；

14、将检测r346k位点、p681h位点的引物对、探针与预混试剂混合，经冻干，得到冻干组分3；

15、将检测6970del位点、t547k的引物对、探针与预混试剂混合，经冻干，得到冻干组分4；制得所述试剂盒。

16、为了确保检测的准确性，在同一冻干组分中，各探针所用的荧光基团均不相同。相比于常规的核酸检测试剂，本发明将引物、探针和预混试剂组合后制成冻干组分，有效提高了试剂的稳定性和可靠性，而且还有效降低了运输成本。本发明所采用的各检测引物和探针互相不会发生交叉反应，也不会形成二级结构，保证了检测效率和检测结果的准确性。

17、本发明还提供了一种非诊断目的的检测新冠病毒突变株的方法，包括以下步骤：

18、(1)对待测样品进行核酸提取，得到核酸提取液；

19、(2)以所述核酸提取液为模板，采用上述引物对和上述探针进行扩增和检测。

20、优选地，所述扩增的条件为：

21、50℃15min，1个循环；

22、95℃5min，1个循环；

23、95℃10s、60℃30s，40个循环。

24、可采用全自动荧光pcr仪进行相应检测，全自动荧光pcr仪的类型包括但不限于abiabi q系列、bio-rad cfx系列、宏石slan系列。

25、相对于现有技术，本发明的有益效果如下：

26、采用本发明所提出的引物和探针进行样品的检测，可一次性区分多种新型冠状病毒突变株(delta、omicron ba.1、omicron ba.1.1、omicron ba.2、omicron ba.3)。前期研究表明，常规pcr引物及探针难以满足多重pcr的要求，本发明通过对引物对及探针的巧妙设计最终得到特定的引物对及探针，避免了多个引物对及对应的检测探针之间的相互干扰，在实现多种新型冠状病毒突变株的鉴定效果的同时，还保持了良好的检测特异性和灵敏度。此外，本发明将引物、探针和预混试剂组合后制成冻干组分，有效提高了试剂的稳定性和可靠性，而且还有效降低了运输成本。

技术特征：

1.一种用于检测新冠病毒突变株的引物对，其特征在于，包括：

2.一种用于检测新冠病毒突变株的探针，其特征在于，包括：

3.根据权利要求2所述的探针，其特征在于，所述检测orf1ab基因、n基因的探针为ddq探针，所述检测p681r位点、d405n位点、r346k位点、p681h位点、6970del位点、t547k的探针为dq探针。

4.一种用于检测新冠病毒突变株的试剂盒，其特征在于，包括：预混试剂、权利要求1所述的引物对和权利要求2-3中任一项所述的探针；所述预混试剂包括dntp、taq酶、mmlv反转录酶、冻干保护剂、rt-pcr缓冲液和水。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述冻干保护剂包含甘氨酸和海藻糖。

6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括检测内参基因rnp的引物对和探针；所述检测内参基因rnp的引物对的核苷酸序列如seq id no:25-26所示，所述检测内参基因rnp的探针的核苷酸序列如seq id no:27所示。

7.权利要求6所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

8.一种非诊断目的的检测新冠病毒突变株的方法，其特征在于，包括以下步骤：

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述扩增的条件为：

技术总结
本发明属于核酸检测技术领域，公开了一种用于检测新冠病毒突变株的引物对、探针及试剂盒。本发明中用于检测新冠病毒突变株的引物对的序列如SEQ ID NO:1‑16所示；用于检测新冠病毒突变株的探针的序列如SEQ ID NO:17‑24所示。采用上述引物对和探针，可一次性实现对Delta、Omicron BA.1、Omicron BA.1.1、Omicron BA.2、Omicron BA.3在内的多种新冠病毒突变株的分型，且检测特异性和检测灵敏度良好。

技术研发人员：曾志奇,李辉,门光琦,师琪,赵蔚诗
受保护的技术使用者：珠海贝索基因技术有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13