一种用于顺行跨单突触神经示踪的系统及其应用

本发明属于生物医学，具体涉及一种用于顺行跨单突触神经示踪的系统及其应用。

背景技术：

1、脑内不同性质和功能的神经元通过各种形式的复杂连接，传递某种特定信息构成神经环路。复杂的神经环路网络为大脑的功能建立稳固的结构基础。通过神经示踪工具可对神经环路进行精确标记，包括顺向和逆向以及是否跨突触。病毒示踪策略可以有效的靶向特定细胞类型，并且通过修改病毒可以有效的在目标细胞内表达特定的小分子示踪剂。尽管以狂犬病毒为代表的逆行跨突触病毒示踪技术取得不错的效果，但是顺行跨突触示踪技术表现相对较差。现有的顺行跨突触病毒，均有多种缺点：如野生型的hsv和prv均具有顺行和逆行跨突触的特点。疱疹病毒h129株的hsv1能优先进行顺行的跨突触传播，但是h129具有较高的细胞毒性，在进行跨多突触示踪的时候，感染h129的小鼠会在3-7天内死亡。最近开发出来的h129-g4能增强荧光表达信号，清楚地标记神经元的树突和树突棘等细节特征，但该病毒能跨多突触，脑区之间的相互连接较多，标记到的下游神经元不能明确是来自于上游脑区，还是其他脑区的反向投射。利用携带不同荧光信号基因的h129可以一定程度上共标脑区。但该方法对于分析不同输入来源的下游投射是不明确的。

2、重组aav(raav)是神经科学家进行顺行示踪标记的首要选择。科学界现普遍认为aav不会导致人类疾病，是目前最有前景的基因治疗载体。aav1在高滴度条件下呈顺向跨突触传播，与cre依赖的报告系统相结合，可高效和特异性地驱动cre依赖的外源基因在突触后神经元中表达，标记突触后神经元。但由于aav1病毒需要借助于cre的放大系统，必须使用如ai14这样依赖于cre系统的转基因小鼠，才能顺行标记神经元。利用aav1-cre的顺行跨单突触特性，可通过输入来源对神经元进行分类。但通过注射单一病毒无法分析接收不同输入来源的脑区神经元。

技术实现思路

1、本发明的目的是克服现有顺行跨单突触示踪技术具有较高的细胞毒性、难以分析不同输入来源的下游投射的问题。

2、为此，本发明提供了一种用于顺行跨单突触神经示踪的系统，包括cre依赖和flp依赖的双报告转基因动物模型，可以利用荧光蛋白表达技术来标记不同上游脑区投射的神经元类型。

3、具体的，上述双报告转基因动物模型通过以下步骤构建：将cre依赖的rose26-eyfp小鼠和flp依赖的frt-tdtomato小鼠杂交，获得杂交子一代，通过基因型鉴定，选取双阳性小鼠，即为双报告转基因动物模型。

4、本发明还提供了一种顺行跨单突触神经示踪方法，包括以下步骤：

5、(1)构建如权利要求1-2任意一项所述的用于顺行跨单突触神经示踪的系统；

6、(2)将携带两种不同重组酶和报告基因的aav1病毒分别注射到双报告转基因动物模型的不同上游脑区中，病毒表达后，观察下游脑区的表达情况；

7、(3)根据脑区神经元胞体分析接收不同输入的下游脑区的神经元表达。

8、具体的，上述步骤(2)具体为：将aav1-hsyn-cre病毒注射到上游脑区pvt，将aav1-hsyn-flpo病毒注射到上游脑区bla，病毒表达后，观察下游脑区的表达情况。

9、具体的，上述步骤(2)中通过脑立体定位系统将病毒注射到双报告转基因动物模型的不同上游脑区中。

10、具体的，上述步骤(2)中在病毒表达2-3周后观察下游脑区的表达情况。

11、本发明提供的用于顺行跨单突触神经示踪的系统和顺行跨单突触神经示踪方法可用于神经环路和特异性神经投射研究。

12、与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：

13、本发明提供的这种用于顺行跨单突触神经示踪的系统是以cre-loxp系统和flp/frt系统相互结合的小鼠为基础，该种小鼠生长健康，而且可以正常繁殖，不影响其他任何表型。本发明采用的aav1病毒毒性相对较小，具有严格的顺行特征，能在高滴度状态下跨单突触传播，能够准确追踪下游投射神经元。采用本发明提供的顺行跨单突触神经示踪方法能够实现在同一脑区精准标记接收来自不同上游脑区投射的神经元，便于后续对不同类型神经元的特性及数量进行分析。

14、以下将结合附图对本发明做进一步详细说明。

技术特征：

1.一种用于顺行跨单突触神经示踪系统，其特征在于：包括cre依赖和flp依赖的双报告转基因动物模型。

2.如权利要求1所述用于顺行跨单突触神经示踪系统，其特征在于，所述双报告转基因动物模型通过以下步骤构建：将cre依赖的rose26-eyfp小鼠和flp依赖的frt-tdtomato小鼠杂交，获得杂交子一代，通过基因型鉴定，选取双阳性小鼠，即为双报告转基因动物模型。

3.一种顺行跨单突触神经示踪方法，其特征在于，包括以下步骤：

4.如权利要求3所述的顺行跨单突触神经示踪方法，其特征在于，所述步骤(2)具体为：将aav1-hsyn-cre病毒注射到上游脑区pvt，将aav1-hsyn-flpo病毒注射到上游脑区bla，病毒表达后，观察下游脑区的表达情况。

5.如权利要求4所述的顺行跨单突触神经示踪方法，其特征在于：所述步骤(2)中在病毒表达2-3周后观察下游脑区的表达情况。

6.如权利要求3所述的顺行跨单突触神经示踪方法，其特征在于，所述步骤(2)中通过脑立体定位技术将病毒注射到双报告转基因动物的不同上游脑区中。

7.如权利要求1-2任意一项所述的用于顺行跨单突触神经示踪系统在神经环路和特异性神经投射研究中的应用。

8.如权利要求3-6任意一项所述的顺行跨单突触神经示踪方法在神经环路和特异性神经投射研究中的应用。

技术总结
本发明属于生物医学技术领域，具体提供了一种用于顺行跨单突触神经示踪的系统，包括Cre依赖和Flp依赖的双报告转基因动物模型。本发明提供的这种用于顺行跨单突触神经示踪的系统是以Cre‑LoxP系统和FLP/FRT系统相互结合的小鼠为基础，该种小鼠生长健康，而且可以正常繁殖，不影响其他任何表型。本发明采用的AAV1病毒毒性相对较小，具有严格的顺行特征，能在高滴度状态下跨单突触传播，能够准确传导至下游投射脑区神经元。采用本发明提供的顺行跨单突触神经示踪方法能够实现在同一脑区精准标记接收来自不同上游脑区投射的神经元类型，便于后续对不同类型神经元的特性及数量进行分析。

技术研发人员：朱英杰,徐花,卢珊珊
受保护的技术使用者：中国科学院深圳先进技术研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/6/5