一种岩藻聚糖多克隆抗体及其在检测岩藻聚糖中的应用的制作方法

本发明属于抗体制备和检测分析，具体涉及一种岩藻聚糖多克隆抗体及其在检测岩藻聚糖中的应用。

背景技术：

1、公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

2、多糖有抗凝血、抗病毒、抗氧化、神经营养和保护等多种生物学活性。因此多糖的药物学研究备受关注。但是由于多糖化学结构复杂，没有特征的紫外吸收。因此目前缺乏一种微量定量的、特异性强的体内检测方法。目前常用的同位素标记法、高效液相色谱法和生物学测定法等都有一些缺陷和不足。免疫学方法因其特异性好、灵敏度高越来越广泛的应用于药代动力学研究。免疫学方法应用的关键是要得到特异性好、亲和力高的抗体。抗体的性质直接决定免疫学方法应用的成功与否。

3、岩藻聚糖(fucoidan)是一种主要来源于褐藻的细胞壁和一些海洋无脊椎动物组织的海洋硫酸多糖，具有良好的生物相容性和抗氧化，抗病毒，免疫调节和抗炎等生物活性。然而，不同来源的岩藻聚糖在结构方面差异较大。例如，海洋无脊椎动物来源的岩藻聚糖的结构组成通常较简单，一般为几种组分有规律的简单重复。而褐藻来源的岩藻聚糖结构较为复杂，通常由两种链结构组成，一个以(1→3)-α-l-吡喃葡萄糖连接为主链，另一个是α-l-吡喃葡萄糖通过(1→3)和(1→4)连接作为主链。值得注意的是，岩藻聚糖的生物活性受多种因素影响，这与其硫酸化程度和分子量密切相关，而对于大多数岩藻聚糖而言，其结构骨架仍不清楚，并且特定硫酸盐基团的位置和分支部位尚未确定。这对阐明其结构-活性关系带来一定难度。同时也不利于学术和商业上的大规模推广和研究应用。

4、众所周知，由于目前市场上销售的大多数岩藻聚糖的来源并不能始终保持一致，并可能由于厂商和批次的不同，而无法确保岩藻聚糖药理活性的稳定性。因此，亟需寻找一种能稳定产生同一构型的、分子量确定不变的岩藻聚糖的动植物或微生物。需要指出的是，由于微生物相较于动植物而言，生产成本低，更加稳定可靠，不容易受外界各种环境因素干扰，所以其优势更加显著。因此，建立一种检测溶液中是否含有岩藻聚糖的方法十分必要，从而用于岩藻聚糖产生菌等的筛选。

技术实现思路

1、针对现有技术，本发明目的在于提供一种岩藻聚糖多克隆抗体及其在检测岩藻聚糖中的应用。本发明以岩藻聚糖多克隆抗体的制备为切入点，通过对其抗体特性的研究为糖类物质多克隆抗体的制备提供方法依据，进而为糖类物质药代动力学的免疫方法的建立提供源头物质基础。基于上述研究成果，从而完成本发明。

2、为了实现上述技术目的，本发明提供的技术方案如下：

3、本发明的一个方面，提供一种岩藻聚糖多克隆抗体，所述岩藻聚糖多克隆抗体是通过将岩藻聚糖-牛血清白蛋白(bsa)共价复合物对非人动物进行免疫获得；其中，所述岩藻聚糖-牛血清白蛋白共价复合物采用如下方法制备得到：将岩藻聚糖、牛血清白蛋白、nacnbh3溶解于碳酸盐缓冲液中恒温反应2-4天，纯化后即得；其中，所述岩藻聚糖、牛血清白蛋白、nacnbh3的质量比为25-35:5-15:1-5。

4、本发明的第二个方面，提供一种用于检测岩藻聚糖的试剂盒，所述试剂盒至少含有上述岩藻聚糖多克隆抗体。

5、所述试剂盒还可以含有其他用于检测岩藻聚糖的组分，如缓冲液等，在此不做具体限定。

6、本发明的第三个方面，提供上述岩藻聚糖多克隆抗体或试剂盒在检测岩藻聚糖中的应用。

7、所述检测可以为定性或定量检测，即判断岩藻聚糖的浓度或有无，具体的，所述检测可基于诸如蛋白质印迹法(western blot)、elisa、抗原抗体反应、荧光染料(如fitc)、胶体金试纸条和蛋白芯片等现有任意一种或多种检测技术进行，在此不再赘述。

8、本发明的第四个方面，提供一种检测岩藻聚糖的方法，所述方法包括：

9、将上述多克隆抗体加入待测溶液中进行孵育处理，然后向其中加入荧光染料标记的岩藻聚糖进行孵育处理，基于荧光强度判断待测溶液中岩藻聚糖的浓度或有无；或，

10、将上述多克隆抗体加入待测溶液中，然后加入hrp标记的二抗，加入tmb显色液进行显色，最后加入h2so4终止反应，450nm读取od值。

11、本发明的第五个方面，提供上述岩藻聚糖多克隆抗体、试剂盒或方法在如下任意一种或多种中的应用：

12、(a)岩藻聚糖产生物的筛选；

13、(b)岩藻聚糖相关基础研究；

14、(c)岩藻多糖质量监控。

15、上述一个或多个技术方案的有益技术效果：

16、上述技术方案公开一种岩藻聚糖多克隆抗体及其在检测岩藻聚糖中的应用，具体的，上述技术方案通过将岩藻聚糖-牛血清白蛋白(bsa)共价复合物对非人动物进行免疫成功获得岩藻聚糖多克隆抗体，并成功将其用于对岩藻聚糖的检测。

17、综上，上述技术方案以岩藻聚糖多克隆抗体的制备为切入点，通过对其抗体特性的研究为糖类物质多克隆抗体的制备提供方法依据，进而为糖类物质药代动力学的免疫方法的建立提供源头物质基础，因此具有良好的实际应用之价值。

技术特征：

1.一种岩藻聚糖多克隆抗体，其特征在于，所述岩藻聚糖多克隆抗体是通过将岩藻聚糖-牛血清白蛋白共价复合物对非人动物进行免疫获得；其中，所述岩藻聚糖-牛血清白蛋白共价复合物采用如下方法制备得到：将岩藻聚糖、牛血清白蛋白、nacnbh3溶解于碳酸盐缓冲液中恒温反应，纯化后即得；其中，所述岩藻聚糖、牛血清白蛋白、nacnbh3的质量比为25-35:5-15:1-5。

2.如权利要求1所述岩藻聚糖多克隆抗体，其特征在于，所述碳酸盐缓冲液的ph9.6；所述纯化采用凝胶层析方法进行。

3.如权利要求2所述岩藻聚糖多克隆抗体，其特征在于，所述纯化方法如下：反应完毕后，用akta蛋白纯化系统连接sephadex g-200柱对样品进行凝胶层析，紫外280nm检测，去除未反应的岩藻聚糖、牛血清白蛋白和nacnbh3，即获得岩藻聚糖-牛血清白蛋白共价复合物。

4.如权利要求1所述岩藻聚糖多克隆抗体，其特征在于，对非人动物进行免疫的方法包括：将岩藻聚糖-牛血清白蛋白共价复合物溶于生理盐水中，然后与弗氏完全佐剂混匀，对非人动物进行免疫获得。

5.如权利要求4所述岩藻聚糖多克隆抗体，其特征在于，岩藻聚糖-牛血清白蛋白共价复合物的盐溶液与弗氏完全佐剂等体积混合，所述混匀方式采用双推法混匀；所述岩藻聚糖在盐溶液中的浓度为1-10mg/ml。

6.如权利要求1所述岩藻聚糖多克隆抗体，其特征在于，所述非人动物包括非人哺乳动物和鸟类，进一步为babl/c小鼠。

7.一种用于检测岩藻聚糖的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒至少含有权利要求1-6任一项所述岩藻聚糖多克隆抗体。

8.权利要求1-6任一项所述岩藻聚糖多克隆抗体或权利要求7所述试剂盒在检测岩藻聚糖中的应用；进一步的，所述检测为定性或定量检测，所述检测基于蛋白质印迹法、elisa、抗原抗体反应、荧光染料、胶体金试纸条和蛋白芯片中的任意一种或多种检测技术进行。

9.一种检测岩藻聚糖的方法，其特征在于，所述方法包括：

10.权利要求1-6任一项所述岩藻聚糖多克隆抗体、权利要求7所述试剂盒或权利要求9所述方法在如下任意一种或多种中的应用：

技术总结
本发明属于抗体制备和检测分析技术领域，具体涉及一种岩藻聚糖多克隆抗体及其在检测岩藻聚糖中的应用。具体的，本发明通过将岩藻聚糖‑牛血清白蛋白(BSA)共价复合物对非人动物进行免疫成功获得岩藻聚糖多克隆抗体，并成功将其用于对岩藻聚糖的检测。本发明以岩藻聚糖多克隆抗体的制备为切入点，通过对其抗体特性的研究为糖类物质多克隆抗体的制备提供方法依据，进而为糖类物质药代动力学的免疫方法的建立提供源头物质基础，因此具有良好的实际应用之价值。

技术研发人员：吉恺,宋淑亮,魏强
受保护的技术使用者：中日友好医院（中日友好临床医学研究所）
技术研发日：
技术公布日：2024/1/11