一种高产苯乳酸的乳酸菌筛选方法

本发明涉及微生物育种技术中的高产菌株快速筛选领域，尤其涉及一种高产苯乳酸的乳酸菌筛选方法。

背景技术：

1、苯乳酸具有抑菌、防腐和保鲜等多种重要功能，因此在农产品的加工及贮藏领域具有广阔前景。目前苯乳酸的生产主要有化学合成和微生物发酵合成两种来源。苯乳酸化学合成法技术繁琐，产物不纯，副产物较多，且易造成污染环境；微生物发酵发面主要采用乳酸菌作为生产菌合成苯乳酸，然而自然界分离得到的一般具有苯乳酸产量低、生长速率慢、培养条件要求高等缺点，难以达到规模化工业生产的需求，这就需要对菌株进行改良、筛选。目前乳酸菌初筛的方法主要是利用溶钙圈法对乳酸菌进行筛选，其原理是乳酸菌产生的酸性物质和碳酸钙反应而出现的溶解圈，从中挑选产生溶钙圈大的菌落；然而，该方法存在现象不明显、容易产生碳酸钙沉淀等问题。

技术实现思路

1、基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种高产苯乳酸的乳酸菌筛选方法。

2、本发明提出的一种高产苯乳酸的乳酸菌筛选方法，采用微生物分离纯化技术从泡菜中分离出乳酸菌，将乳酸菌加入到液体mrs培养基中培养，得到菌悬液；将菌悬液涂布到mrs琼脂碳酸钙培养基上培养，得到乳酸菌菌落；将含有菌落的mrs琼脂碳酸钙培养基平板从培养皿中分离出，并将上述培养基平板置于含中性红指示剂的mrs琼脂培养基平板上，形成双重平板，封口，培养；根据菌落周围形成的红色透明圈的大小筛选出高产苯乳酸菌。

3、优选地，将乳酸菌加入到液体mrs培养基中于27～32℃下培养1-3d，得到菌悬液。

4、优选地，将菌悬液涂布到mrs琼脂碳酸钙培养基上于27～32℃下培养2-3d，得到乳酸菌菌落。

5、优选地，将菌悬液涂布到mrs琼脂碳酸钙培养基上之前，还包括按十倍稀释法采用生理盐水按将菌悬液稀释，制成10-5～10-6倍稀释度的稀释液。

6、优选地，所述含中性红指示剂的mrs琼脂培养基平板中，中性红指示剂的含量为0.1500～0.1750g/l；其制备是将中性红指示剂加入到mrs琼脂培养基中得到的。

7、优选地，封口后，于27～32℃下培养2-3d。

8、现有技术中，乳酸菌筛常选用溶钙圈法，是利用乳酸菌产生的苯乳酸可以溶解平板中的碳酸钙形成透明钙圈，但是钙圈的大小尤其是钙圈的边界不是太明显，尤其到了菌体生长的中后期，尽管此时菌体大量合成苯乳酸，但是钙圈会更加模糊，往往会影响苯乳酸产量的判断。

9、如果采用中性红显色反应法，平板中加入中性红后菌落周围由于苯乳酸的形成开始出现深红色菌圈，但是菌圈的边界与周围的培养基界限不明显，同时由于早期中性红的加入对菌体的生长和苯乳酸的形成都会有抑制作用，这也会影响苯乳酸产量的判断。

10、与现有技术相比，本发明采用双重平板法筛选乳酸菌，即将含乳酸菌菌落的碳酸钙培养基平板与含中性红指示剂的培养基平板按照上下顺序叠放在一起，下层平板中的中性红指示剂会渗透到上层平板中，与上层平板中的苯乳酸产生明显的颜色反应而呈现红色，再由于乳酸菌产生的苯乳酸可以溶解平板中的碳酸钙形成透明钙圈，从而最终在上层平板的菌落周围形成明显的红色透明圈，根据红色透明圈的大小，即可以判断乳酸菌产苯乳酸的能力强弱。

11、本发明建立了一种基于透明钙圈法和显色反应法两种技术的乳酸菌筛选新方法，该方法简单易操作，由于菌落形成的苯乳酸都分布在透明钙圈内，而此处的中性红遇到苯乳酸颜色变深，它使得碳酸钙的透明圈更加明显，更加容易和准确地判断苯乳酸的产量，在高产苯乳酸的菌株诱变育种过程中可以更加准确地快速筛选目标菌株。

技术特征：

1.一种高产苯乳酸的乳酸菌筛选方法，其特征在于，采用微生物分离纯化技术从泡菜中分离出乳酸菌，将乳酸菌加入到液体mrs培养基中培养，得到菌悬液；将菌悬液涂布到mrs琼脂碳酸钙培养基上培养，得到乳酸菌菌落；将含有菌落的mrs琼脂碳酸钙培养基平板从培养皿中分离出，并将上述培养基平板置于含中性红指示剂的mrs琼脂培养基平板上，形成双重平板，封口，培养；根据菌落周围形成的红色透明圈的大小筛选出高产苯乳酸菌。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，将乳酸菌加入到液体mrs培养基中于27～32℃下培养1-3d，得到菌悬液。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，将菌悬液涂布到mrs琼脂碳酸钙培养基上于27～32℃下培养2-3d，得到乳酸菌菌落。

4.如权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，将菌悬液涂布到mrs琼脂碳酸钙培养基上之前，还包括按十倍稀释法采用生理盐水将菌悬液稀释，制成10-5～10-6倍稀释度的稀释液。

5.如权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述含中性红指示剂的mrs琼脂培养基平板中，中性红指示剂的含量为0.1500～0.1750g/l；其制备是将中性红指示剂加入到mrs琼脂培养基中得到的。

6.如权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，封口后，于27～32℃下培养2-3d。

技术总结
本发明公开了一种高产苯乳酸的乳酸菌筛选方法，从泡菜中分离出乳酸菌，将乳酸菌加入到液体MRS培养基中培养，得到菌悬液；将菌悬液涂布到MRS琼脂碳酸钙培养基上培养；将含有菌落的MRS琼脂碳酸钙培养基平板从培养皿中分离出，并将其置于含中性红指示剂的MRS琼脂培养基平板上，形成双重平板，封口，培养；根据菌落周围形成的红色透明圈的大小筛选出高产苯乳酸菌。本发明采用双重平板法筛选乳酸菌，由于菌落形成的苯乳酸都分布在上层平板的透明钙圈内，而此处由下层平板渗透上来的中性红遇到苯乳酸颜色变深，它使得碳酸钙的透明圈更加明显，更容易和准确地判断苯乳酸的产量，在高产苯乳酸的菌株诱变育种过程中可以更加准确地快速筛选目标菌株。

技术研发人员：刘京华,吴璐璐,孟国庆,郭燕风,王传宝,宋磊
受保护的技术使用者：菏泽学院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12