检测IGH基因重排及超突变的引物组、方法和系统与流程

本发明属于分子生物学，更具体地，本发明涉及一种检测igh基因重排及超突变的引物组、试剂盒、系统和方法。

背景技术：

1、淋巴细胞不同于体内的其他体细胞，在发育过程中，淋巴细胞中的抗原受体基因发生体细胞基因重排。例如，在b细胞发育过程中，编码igh分子的基因由多个多态基因片段组装而成，这些基因片段经历重排和选择，产生长度和序列均独一无二的vh-dh-jh组合。由于白血病和淋巴瘤起源于个体淋巴细胞的恶性转化，个体的白血病或淋巴细胞通常共享一个或多个细胞特异性或“克隆”抗原受体基因重排。因此，检测igh克隆重排的测试可用于b细胞肿瘤的研究。

2、此外，免疫球蛋白重链可变区(ighv)基因超突变状态为慢性淋巴细胞白血病(cll)和小淋巴细胞淋巴瘤(sll)患者提供了重要的预后信息。ighv体细胞超突变(shm)的存在被定义为与种系vh基因序列的差异大于或等于2％，而小于2％的差异被认为是没有shm的证据。克隆的shm状态与b-cll具有临床相关性，因为有和没有shm的患者的中位生存期有明显区别。ighv区域的超突变强烈预示着良好的预后，而缺乏突变则预示着不良的预后。

3、最初是使用限制性片段、southern印迹杂交技术(rf-sbh)鉴定克隆重排。然而，这些技术较为繁琐且需要大量的dna，并且不适合分析许多不太多样化的单克隆重排。在过去的几十年里，rf-sbh检测已被基于pcr的克隆性检测所取代，并被认为是当前的金标准方法。基于pcr的克隆性分析技术，敏感性较高，结果直观可靠，但检测周期较长，难以区分相似的克隆群体和可能位于单一大小峰下方的多重重排，并且无法识别在后续跟踪分析中所需的克隆特异性dna序列。但这个限制非常重要，因为一旦确定了独特的克隆特异性dna序列，该序列就可以用于后续测试，以便继续跟踪独特的克隆细胞群。

4、近几年，ngs的引入使得对igh基因重排的更深入分析成为可能，该技术对于igh基因的克隆重排检测更加敏感和特异，主要是由于二代测序结果提供了独特的核酸序列。因此，用于评估免疫球蛋白受体(igh)克隆重排的灵敏度有所提高，可以进一步应用于mrd检测、谱分析。目前基于ngs平台的igh基因重排及超突变商业化试剂盒主要搭配illumina平台的miseq测序仪，测序读长600bp，仅测序时间就需要4天，以及ilumina下机数据处理较为复杂。整个构库、测序、数据分析处理时间需要约7天，导致检测周期过长，较为影响临床治疗。

5、因此，有必要提供一种灵敏度高、检测周期短、成本低的检测igh基因重排及超突变的方法。

技术实现思路

1、基于此，本发明的目的在于提供一种检测igh基因重排及超突变的引物组、试剂盒、系统和方法。

2、实现上述发明目的的技术方案包括如下。

3、本发明的第一个方面，是提供了一种检测igh基因重排及超突变的引物组，包括：序列如seq id no.1～seq id no.7所示的正向引物、和序列如seq idno.8所示的反向引物。

4、本发明的第二个方面，是提供了一种检测igh基因重排及超突变的试剂盒，所述试剂盒包括上述检测igh基因重排及超突变的引物组。

5、本发明的第三个方面，是提供了一种检测igh基因重排及超突变的方法，包括以下步骤：以待测样本的dna为模板，采用上述试剂盒进行igh基因序列的pcr扩增，对扩增产物进行末端修复后，连接特异性接头，再进行文库扩增，对文库进行上机测序。

6、本发明的第四个方面，是提供了一种检测igh基因重排及超突变的系统，包括以下模块：

7、检测模块，包括igh基因扩增模块、文库构建模块、iongenestudios5plus测序模块；所述igh基因扩增模块包括：序列如seq id no.1～seq id no.7所示的正向引物和序列如seq id no.8所示的反向引物；

8、分析模块，所述分析模块对所述iongenestudios5plus测序模块的测序结果进行分析。

9、在本发明中，根据igh基因的目标扩增区域设计筛选了特异性引物，并通过优化文库构建方法，结合iongenestudios5plus测序平台，可以实现对igh基因目标区域的高质量和高效率的扩增，测序读长降低，准确率得以提高，大大缩短igh基因重排及超突变的检测周转时间(从dna提取到报告发放只需3天)，使医生能够在最早的时间内拿到检测结果，更加及时地辅助病况诊断、制定合理治疗方案，具有广泛的市场前景和巨大的社会价值。

技术特征：

1.一种检测igh基因重排及超突变的引物组，其特征在于，所述引物组包括：序列如seqid no.1～seq id no.7所示的正向引物、以及序列如seq idno.8所示的反向引物。

2.权利要求1所述的引物组在制备检测igh基因重排及超突变的试剂盒中的应用。

3.一种检测igh基因重排及超突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的检测igh基因重排及超突变的引物组。

4.根据权利要求3所述的检测igh基因重排及超突变的试剂盒，其特征在于，所述引物组的工作浓度为3μm～5μm。

5.一种检测igh基因重排及超突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：以待测样本的dna为模板，采用权利要求3或4所述试剂盒进行igh基因序列的pcr扩增，对扩增产物进行末端修复后，连接特异性接头，再进行文库扩增，对文库进行上机测序。

6.根据权利要求5所述的检测igh基因重排及超突变的方法，其特征在于，所述pcr扩增的反应体系包括：ddh2o 10.15±0.1μl、10×buffer 2±0.1μl、mgcl21.2±0.1μl、dntp mix0.4±0.1μl、引物组混合物1±0.1μl、dna polymerase 0.25±0.05μl、dna 5±0.1μl；和/或所述pcr扩增的反应程序包括：95℃5min；95℃45s，60℃45s，72℃60s，35个循环；75℃10min；4℃∞。

7.根据权利要求5所述的检测igh基因重排及超突变的方法，其特征在于，所述文库扩增的反应体系包括：pcr supermix high fidelity 50±2μl、library amplificationprimermix 2.5±0.5μl、unamplified library 12.5±0.5μl。

8.根据权利要求5所述的检测igh基因重排及超突变的方法，其特征在于，所述文库扩增的反应程序包括：95℃5min；95℃15s，58℃15s，70℃60s，7个循环；4℃∞。

9.根据权利要求5所述的检测igh基因重排及超突变的方法，其特征在于，采用iongenestudio s5 plus平台进行上机测序。

10.一种检测igh基因重排及超突变的系统，其特征在于，包括以下模块：

技术总结
本发明公开了一种检测IGH基因重排及超突变的引物组、方法和系统，所述引物组包括序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.7所示的正向引物、和序列如SEQ ID NO.8所示的反向引物。本发明可以实现对IGH基因目标区域的高质量和高效率的扩增，测序读长降低，准确率得以提高，大大缩短IGH基因重排及超突变的检测周期，使医生能够在最早的时间内拿到检测结果，更加及时地辅助病况诊断、制定合理治疗方案，具有广泛的市场前景和巨大的社会价值。

技术研发人员：郭慈琳,李露,易煜庭,胡昌明,王华文,甘立佳
受保护的技术使用者：广州金域医学检验中心有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12