传染性法氏囊病病毒新型变异株荧光定量PCR检测引物、探针及试剂盒的制作方法

本发明属于病毒检测，具体涉及传染性法氏囊病病毒新型变异株荧光定量pcr检测引物、探针及试剂盒。

背景技术：

1、传染性法氏囊病(infectious bursal disease，ibd)是由传染性法氏囊病病毒(ibdv)引起青年鸡的急性、高度接触性传染病。ibd不仅能引起鸡群的死亡，而且还能引起雏鸡的免疫抑制，导致机体免疫应答水平降低，并发或继发其他疾病，本病是危害我国养禽业的主要疫病之一，以法氏囊炎、坏死、萎缩和法氏囊内淋巴细胞严重受损为特征，从而引起鸡的免疫机能障碍，降低机体对疫苗的反应强度。ibdv为双rna病毒科(birnaviridae)双rna病毒属(birnavirus)，其基因组由a和b两个节段组成(dobos,p.,etal.1979.biophysical and biochemical characterization of 5animal viruses withbisegmented double-stranded rna genomes.journal of virology,32(2),593-605)。基因组a节段中大orf全长3036bp，编码108kda左右的多聚蛋白nh2-pvp2-vp4-vp3-cooh，经vp4水解成pvp2、vp4和vp3蛋白，小orf编码vp5蛋白(kibenge,f.,et al.1997.infectiousbursal disease virus polyprotein processing does not involve cellularproteases.archives of virology,142(12),2401-2419)。基因组b节段大小为2.8kb，编码90kda左右的vp1蛋白。根据ibdv的致病性和抗原差异，ibdv野毒株的血清ⅰ型可分为经典毒株、变异毒株和超强毒株(cosgrove,a.s.,1962.an apparently new disease ofchickens:avian nephrosis.avian diseases,6(3),385-389)。然而，最近一种不同于早期变异株的ibdv新型变异株在我国呈现流行趋势(xu,a.,et al.2019.phylogeneticanalyses and pathogenicity of a variant infectious bursal disease virusstrain isolated in china.virus research,276)，感染鸡无明显的外观症状，但鸡群的中枢免疫器官法氏囊严重萎缩，导致鸡群严重的免疫抑制和生产性能下降，给养禽业带来了新的威胁。ibd实验室常规诊断方法有病毒中和实验、rt-pcr、琼脂糖凝胶扩散实验和酶联免疫吸附实验等。这些方法相对复杂，且对新毒株的鉴别能力不强，那么开发新的快速、有效且程序简单的鉴别群内ibdv毒株的诊断技术成为一种迫切需求。

技术实现思路

1、本发明的目的在于针对现有技术中的上述问题，提供一种传染性法氏囊病病毒新型变异株荧光定量pcr检测引物、探针及试剂盒，采用该引物和探针，可以快速、准确、特异地对ibdv新型变异株进行扩增、诊断，且程序简单，可以有效监测ibdv新型变异株流行情况。

2、为达到以上技术目的，本申请采用的技术方案如下：

3、第一方面，本发明提供一种传染性法氏囊病病毒新型变异株荧光定量pcr引物，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物和所述下游引物序列分别如seq id no:1和seq id no:2所示。

4、第二方面，本发明提供一种与上述引物匹配用于传染性法氏囊病病毒新型变异株荧光定量pcr检测的探针，所述探针序列如seq id no:3所示。

5、进一步地，所述探针的3’端结合荧光淬灭基团，5’端结合荧光报告基团。

6、优选地，所述荧光淬灭基团为bhq-1，所述荧光报告基团为fam。

7、第三方面，本发明提供上述引物和/或探针在制备传染性法氏囊病病毒新型变异株荧光定量pcr检测产品中的用途。

8、进一步地，所述检测产品包括试剂盒、试纸。

9、第四方面，本发明提供一种传染性法氏囊病病毒新型变异株荧光定量pcr检测试剂盒，包括上述引物和探针。

10、第五方面，本发明提供一种传染性法氏囊病病毒新型变异株荧光定量pcr检测试纸，包括上述引物和探针。

11、第六方面，本发明提供一种非诊断目的鉴别传染性法氏囊病病毒新型变异株的方法，包括：

12、(1)配置阴性对照、阳性对照以及待检测样品的pcr反应体系，其中，pcr反应体系中所使用的引物探针分别为seq id no:1和seq id no:2所示引物和seq id no:3所示探针；

13、(2)pcr反应体系扩增；

14、(3)根据pcr反应体系的扩增曲线，判定待测样品中传染性法氏囊病病毒新型变异株，判定方式为：

15、有扩增曲线出现且ct值小于35的判定为ibdv新型变异株阳性，ct值大于35的判定为ibdv新型变异株阴性。

16、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明设计针对ibdv新型变异株的荧光定量pcr检测引物和探针，采用该引物和探针检测ibdv新型变异株，特异性和灵敏度都较高，可以对ibdv新型变异株的各种临床样品进行快速便捷地检测。

技术特征：

1.传染性法氏囊病病毒新型变异株荧光定量pcr引物，其特征在于：所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物和所述下游引物序列分别如seq id no:1和seq id no:2所示。

2.与权利要求1所述引物匹配用于传染性法氏囊病病毒新型变异株荧光定量pcr检测的探针，其特征在于：所述探针序列如seq id no:3所示。

3.根据权利要求2所述的探针，其特征在于：所述探针的3’端结合荧光淬灭基团，5’端结合荧光报告基团。

4.根据权利要求3所述的探针，其特征在于：所述荧光淬灭基团为bhq-1，所述荧光报告基团为fam。

5.权利要求1所述的引物和/或权利要求2～4任意一项所述的探针在制备传染性法氏囊病病毒新型变异株荧光定量pcr检测产品中的用途。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述检测产品包括试剂盒、试纸。

7.一种传染性法氏囊病病毒新型变异株荧光定量pcr检测试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的引物和权利要求2～4任意一项所述的探针。

8.一种传染性法氏囊病病毒新型变异株荧光定量pcr检测试纸，其特征在于：包括权利要求1所述的引物和权利要求2～4任意一项所述的探针。

9.一种非诊断目的鉴别传染性法氏囊病病毒新型变异株的方法，其特征在于：包括：

技术总结
本发明提供一种传染性法氏囊病病毒新型变异株荧光定量PCR检测引物、探针及试剂盒，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物和所述下游引物序列分别如SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2所示。所述探针序列如SEQ ID NO:3所示。采用该引物和探针，可以快速、准确、特异地对IBDV新型变异株进行扩增、诊断，且程序简单，可以有效监测IBDV新型变异株流行情况。

技术研发人员：曹雪珍,李群辉,周庆丰,李薇,林丽苗
受保护的技术使用者：温氏食品集团股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15