重组乙型流感病毒及其制备方法与应用

本申请涉及生物医药，具体涉及一种重组乙型流感病毒及其制备方法与应用。

背景技术：

1、季节性流感是由甲型流感病毒和乙型流感病毒共同引起的。其中，乙型流感病毒感染的病例占每年所有流感病例的25％。乙型流感病毒感染能够诱发儿童、老人、免疫力低下的成年人出现严重并发症甚至死亡，严重威胁人类健康。

2、与甲型流感病毒相同，乙型流感病毒主要依靠病毒粒子表面的糖蛋白，特别是血凝素蛋白(hemagglutinin，ha)抗原特性的改变，来逃避机体已有的免疫保护，从而导致流感持续流行。乙型流感病毒根据血凝素的抗原性和ha1区域核苷酸序列的不同，可分为两大谱系：以victoria/2/87样病毒为代表的victoria谱系和以b/yamagata/16/88样病毒为代表的yamagata谱系。研究表明，这两个谱系至少在1983年就开始在世界范围内同时流行。

3、疫苗接种是预防和控制流感的有效措施。目前已上市获批的季节性流感疫苗包含有裂解疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗等不同类型的三价或四价疫苗。最初，季节性流感疫苗为三价疫苗，包括甲型h1n1、甲型h3n2、乙型victoria谱系或yamagata谱系毒株。由于很难准确地预测哪一谱系的乙型流感病毒将会在下一个流行季中占主导地位，所以经常出现三价流感疫苗中的乙型流感疫苗毒株与当季流行毒株错配的现象，从而导致三价疫苗的有效性降低。自2013年起，季节性流感疫苗的研发增加了四价疫苗，即同时包含了victoria和yamagata两种谱系的乙型流感疫苗株。虽然已有研究表明，四价流感疫苗具有良好的安全性和非劣等的免疫原性，且可以为机体提供更全面的保护。但是，四价疫苗株较三价疫苗增加了一种疫苗组成成分，其制备过程中需要额外增加一种谱系乙型流感疫苗株的生产与配伍，从而导致四价流感疫苗的成本升高、产能降低，同时也增加了流感疫苗的生产负担和经济成本，限制了其在全球范围内的普及使用。因此，迫切需要研制新型疫苗株来同时预防两种谱系乙型流感病毒的感染。

技术实现思路

1、基于此，本申请提供了一种能够同时表达victoria谱系和yamagata谱系血凝素蛋白的重组乙型流感病毒及其制备方法与应用。

2、本申请解决上述技术问题的技术方案如下。

3、根据本申请的一个方面，提供了一种重组乙型流感病毒，所述重组乙型流感病毒携带一谱系乙型流感病毒的重组非结构蛋白，所述重组非结构蛋白嵌合有另一谱系乙型流感病毒的重组血凝素蛋白；

4、所述重组血凝素蛋白具有如seq id no.2所示的氨基酸序列；

5、所述重组非结构蛋白具有如seq id no.4所示的氨基酸序列。

6、在其中一个实施例中，编码所述重组血凝素蛋白的核苷酸如seq id no.1所示，和/或，编码所述重组非结构蛋白的核苷酸如seq id no.3所示。

7、在其中一个实施例中，所述重组乙型流感病毒具有如下特征中的一个或多个：

8、(1)具有如seq id no.5所示的核苷酸；和

9、(2)编码如seq id no.6所示的蛋白。

10、在其中一个实施例中，所述重组非结构蛋白来自victoria谱系乙型流感病毒；所述重组血凝素蛋白来自yamagata谱系乙型流感病毒。

11、在其中一个实施例中，所述victoria谱系乙型流感病毒为b/brisbane/60/2008；和/或，所述yamagata谱系乙型流感病毒为b/phuket/3073/2013。

12、本申请还提供了一种上述的重组乙型流感病毒的制备方法，包括以下步骤：

13、合成包含编码所述重组非结构蛋白以及所述重组血凝素蛋白的基因片段；

14、构建携带所述基因片段的重组pm质粒；

15、将所述质粒与携带编码乙型流感病毒pb1、pb2、pa、np、ha、m和na基因的pm重组质粒共同转染细胞，拯救所述重组乙型流感病毒；和

16、收集所述转染的上清液，接种于鸡胚中扩增，制备所述重组乙型流感病毒。

17、本申请还提供了分离的核酸，选自seq id no.1、seq id no.3和seq idno.5中的一种或多种。

18、本申请还提供了一种流感疫苗，包括上述的重组乙型流感病毒。

19、在其中一个实施例中，所述疫苗为全病毒灭活疫苗。

20、本申请还提供了一种中和抗体，使用上述的重组乙型流感病毒制备。

21、有益效果：

22、本申请构建了一种重组乙型流感病毒，该重组乙型流感病毒可稳定地同时表达乙型流感victoria谱系病毒的表面抗原血凝素ha蛋白全长，以及yamagata谱系流感病毒的表面蛋白血凝素ha1、跨膜区(tm)和胞浆尾(ct)的融合蛋白。所构建的重组乙型流感病毒能够自主生长复制，但其体外复制能力低于野生背景毒株。用该重组病毒制备灭活疫苗株免疫小鼠，可有效保护致死剂量的victoria和yamagata两谱系乙型流感病毒对小鼠的攻击。本申请获得的重组乙型流感病毒可作为预防两谱系乙型流感病毒的二价候选疫苗株，对简化四价流感疫苗的生产过程、降低其生产成本具有重要的实际应用价值。

技术特征：

1.一种重组乙型流感病毒，其特征在于，所述重组乙型流感病毒携带一谱系乙型流感病毒的重组非结构蛋白，所述重组非结构蛋白嵌合有另一谱系乙型流感病毒的重组血凝素蛋白；

2.根据权利要求1所述的重组乙型流感病毒，其特征在于，编码所述重组血凝素蛋白的核苷酸如seq id no.1所示，和/或，编码所述重组非结构蛋白的核苷酸如seq id no.3所示。

3.根据权利要求2所述的重组乙型流感病毒，其特征在于，所述重组乙型流感病毒具有如下特征中的一个或多个：

4.根据权利要求1～3任一项所述的重组乙型流感病毒，其特征在于，所述重组非结构蛋白来自victoria谱系乙型流感病毒；所述重组血凝素蛋白来自yamagata谱系乙型流感病毒。

5.根据权利要求4所述的重组乙型流感病毒，其特征在于，所述victoria谱系乙型流感病毒为b/brisbane/60/2008；和/或，所述yamagata谱系乙型流感病毒为b/phuket/3073/2013。

6.一种如权利要求1～5任一项所述的重组乙型流感病毒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

7.分离的核酸，选自seq id no.1、seq id no.3和seq id no.5中的一种或多种。

8.一种流感疫苗，其特征在于，包括权利要求1～5任一项所述的重组乙型流感病毒。

9.根据权利要求8所述的流感疫苗，其特征在于，所述疫苗为全病毒灭活疫苗。

10.一种中和抗体，其特征在于，使用权利要求1～5任一项所述的重组乙型流感病毒制备。

技术总结
本申请提供了一种重组乙型流感病毒及其制备方法与应用，所述重组乙型流感病毒携带一谱系乙型流感病毒的重组非结构蛋白，所述重组非结构蛋白嵌合有另一谱系乙型流感病毒的重组血凝素蛋白。该重组乙型流感病毒可自主生长复制，能同时表达两种谱系乙型流感病毒株的HA蛋白，且插入的外源HA融合基因具有良好的遗传稳定性。本申请获得的重组乙型流感病毒可作为乙型流感二价疫苗的候选毒株，具有重要的应用价值。

技术研发人员：潘蔚绮,董记,冯培,高宇
受保护的技术使用者：广州医科大学附属第一医院（广州呼吸中心）
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12