一种抑制黑化反应、低内毒素的家蚕血淋巴液的制备方法与流程

本发明涉及细胞生物学，具体的说，是一种抑制黑化反应、低内毒素的家蚕血淋巴液的制备方法。

背景技术：

1、细胞培养是模拟细胞来源和组织环境的条件，在体外容器中进行培养的一种实验技术，是生物学、生物化学和医学等各个研究领域种不可缺少的工具。维持细胞的体外培养不仅需要提供适宜的培养基类型、空气成分和温度，还要向细胞生长介质中添加血清，以补充细胞生长所需的全面的营养物质，包括激素、生长因子、结合蛋白、附着和扩散因子等。目前市面上血清的主要来源是胎牛血清(fbs)，获取胎牛血清需要将胎牛从待宰怀孕母牛腹中取出，在无菌环境下通过心脏穿刺抽取胎牛血液，为提高采血量，通常会用特殊仪器对心脏搏动进行刺激。据报道，全世界胎牛血清年产量超过500000l，这意味着每年有超过1,000,000头胎牛被屠宰，这引发了人们对动物福利的担忧。

2、家蚕蛹期变态发育过程中，组织细胞生命活动强度较幼虫期更为旺盛，涉及各种激素的分泌和生长因子的合成，大量研究表明，其富含的活性蛋白还有延长细胞寿命和抑制细胞凋亡的作用，这意味着家蚕蛹期血淋巴可以成为胎牛血清良好的替代品。但由于家蚕生存环境中存在大量革兰氏阴性菌，当细菌侵入家蚕体内时，会激活家蚕酚氧化酶原系统发生黑化反应，并催化形成大量具有细胞毒性的醌衍生物，而裂解的细菌则向血淋巴释放出内毒素。有研究显示，不经过加热灭活酚氧化酶的血淋巴液，无法诱导细胞生长增殖；而在培养液中添加维生素c的方法，对酚氧化酶活性抑制效果较差，随着培养时间增长，vc浓度下降，有毒醌迅速积累，导致现有技术提取的家蚕血淋巴无法直接用于细胞的体外长期培养。因此急需找到一种可以抑制黑化反应、低内毒素的家蚕血淋巴提取方法。相关研究，目前还未见报道。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种抑制黑化反应、低内毒素的家蚕血淋巴液的制备方法，针对现有技术提取的家蚕血淋巴液中含有大量内毒素，对细胞体外培养极为不利，也是制约昆虫血淋巴液取代胎牛血清的瓶颈之一，本发明能够减少家蚕淋巴液中的内毒素浓度；针对黑化反应而产生的醌衍生物所产生的问题，本发明能够降低家蚕血淋巴液中的酚氧化酶原活性，长期抑制血淋巴液的黑化反应，减少有毒醌的积累，使制备的家蚕血淋巴液能用于体外细胞的长期培养。

2、本发明通过下述技术方案实现：一种抑制黑化反应、低内毒素的家蚕血淋巴液的制备方法，包括下述步骤：

3、1)低内毒素蚕品种选取：选取使用无菌蚕，在无菌环境中培养至蛹期；

4、2)蚕体消毒及杂质去除：在无菌操作台上，取蛹期2-3天的无菌蚕，使用酒精消毒蛹体，然后冲洗；

5、3)蚕体低温麻醉：经步骤2)后，将蚕蛹表面水分除去，再将蚕蛹置于冰上低温麻醉1～5分钟，优选的低温麻醉3min；

6、4)血淋巴液的收集：使用无菌解剖刀割开蚕蛹胸节与腹节的连接膜，在蛹的背部形成一个开放性伤口，用手指轻轻挤压蛹头部和尾部的同时，使用巴斯德吸液管收集溢出的血淋巴液；

7、5)抗黑化处理：在获得的血淋巴液中按30～60mmol/l加入谷氨酰胺，优选的按40mmol/l加入谷氨酰胺；

8、6)酚氧化酶灭活处理：经步骤5)充分溶解后，60℃水浴30～45分钟；

9、7)去沉淀处理：经步骤6)后，冷却至2～4℃(优选为4℃)后，1000×g离心10min，取上清液用0.1～0.2μm孔径的滤膜过滤1～2次，优选的取上清液用0.2μm孔径的滤膜过滤2次；

10、8)无氧保存处理：经步骤7)后，即得抑制黑化反应、低内毒素的家蚕血淋巴液，而后采用真空密封包装。

11、所得家蚕血淋巴液(真空密封包装态)需冷冻保存及运输，保质期12个月。使用时需逐步解冻，不可反复冻融。

12、进一步的为更好地实现本发明所述的一种抑制黑化反应、低内毒素的家蚕血淋巴液的制备方法，特别采用下述设置方式：所述无菌蚕选用无菌人工饲料饲喂的无菌蚕。

13、进一步的为更好地实现本发明所述的一种抑制黑化反应、低内毒素的家蚕血淋巴液的制备方法，特别采用下述设置方式：所述使用酒精消毒蛹体具体为：使用体积比浓度为75％的酒精棉球擦拭蛹体。

14、进一步的为更好地实现本发明所述的一种抑制黑化反应、低内毒素的家蚕血淋巴液的制备方法，特别采用下述设置方式：所述步骤2)中，冲洗时，采用pbs缓冲液或无菌水。

15、进一步的为更好地实现本发明所述的一种抑制黑化反应、低内毒素的家蚕血淋巴液的制备方法，特别采用下述设置方式：所述将蚕蛹表面水分除去具体为：使用无菌吸水纸将蚕蛹擦干水分。

16、进一步的为更好地实现本发明所述的一种抑制黑化反应、低内毒素的家蚕血淋巴液的制备方法，特别采用下述设置方式：所述步骤6)中水浴时间为30分钟或45分钟。

17、本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：

18、1、家蚕蛹期组织细胞生命活动旺盛，其血淋巴液中含有丰富的脂质、蛋白质、激素和生长因子。采用本发明，由无菌蚕制成的细胞培养液不仅可以为体外细胞提供充足的营养物质，还能降低血淋巴内毒素，抑制黑化反应，提高体外细胞的生长速率。

19、2、家蚕生存环境中存在大量革兰氏阴性菌，导致现有技术方法提取的家蚕血淋巴液中含有大量内毒素，对细胞体外培养极为不利，也是制约昆虫血淋巴液取代胎牛血清的瓶颈之一，本发明能减少家蚕淋巴液中的内毒素浓度。

20、3、蚕血淋巴液中的酚氧化酶原系统在接触抗原后会激活黑化反应，催化出大量具有细胞毒性的醌衍生物，现有技术方法用添加vc的方法来抑制黑化反应，但随着vc的降解和代谢，有毒醌会快速累积，导致细胞无法生长，甚至死亡。本发明能降低家蚕血淋巴液中的酚氧化酶原活性，长期抑制血淋巴液的黑化反应，减少有毒醌的积累，使制备的家蚕血淋巴液能用于体外细胞的长期培养。

21、4、本发明以降低家蚕血淋巴液中主要细胞毒性物质为出发点，根据内毒素产生规律，选用无菌人工饲料饲育的无菌蚕，从根源上减少了细菌对血淋巴的污染，因此本发明制备的血淋巴液中由细菌产生的内毒素含量极低，此方法操作简单，减少了复杂的去内毒素工艺，成本低廉。

22、5、本发明以降低家蚕血淋巴液中主要细胞毒性物质为出发点，根据昆虫血淋巴黑化反应原理，通过水浴加热的方式对酚氧化酶原进行彻底灭活，再用添加谷氨酰胺的方法，长期抑制家蚕血淋巴黑化反应，使家蚕血淋巴液中的醌衍生物长期处于较低浓度，对细胞的长期培养更为有利。

23、6、本发明为提高血淋巴液培养的体外细胞生长速率，根据家蚕蛹期生命活动旺盛的特点，选择蛹期2-3天的蚕蛹作为血淋巴供体，此时期的血淋巴营养物质和促生长因子含量丰富，对细胞的促生长效果较好。与其他血淋巴提取方法相比，本发明所用蚕的蛹期时间较5龄期更长，且蚕蛹无需进食，可以通过低温储存，用于血淋巴提取的时间远超5龄蚕。

技术特征：

1.一种抑制黑化反应、低内毒素的家蚕血淋巴液的制备方法，其特征在于：包括下述步骤：

2.根据权利要求1所述的一种抑制黑化反应、低内毒素的家蚕血淋巴液的制备方法，其特征在于：所述无菌蚕选用无菌人工饲料饲喂的无菌蚕。

3.根据权利要求1或2所述的一种抑制黑化反应、低内毒素的家蚕血淋巴液的制备方法，其特征在于：所述使用酒精消毒蛹体具体为：使用体积比浓度为75%的酒精棉球擦拭蛹体。

4.根据权利要求1或2所述的一种抑制黑化反应、低内毒素的家蚕血淋巴液的制备方法，其特征在于：所述步骤2）中，冲洗时，采用pbs缓冲液或无菌水。

5.根据权利要求1或2所述的一种抑制黑化反应、低内毒素的家蚕血淋巴液的制备方法，其特征在于：所述将蚕蛹表面水分除去具体为：使用无菌吸水纸将蚕蛹擦干水分。

6.根据权利要求3所述的一种抑制黑化反应、低内毒素的家蚕血淋巴液的制备方法，其特征在于：所述步骤6）中水浴时间为30分钟至45分钟。

7.根据权利要求4所述的一种抑制黑化反应、低内毒素的家蚕血淋巴液的制备方法，其特征在于：所述步骤6）中水浴时间为30分钟或45分钟。

8.根据权利要求5所述的一种抑制黑化反应、低内毒素的家蚕血淋巴液的制备方法，其特征在于：所述步骤6）中水浴时间为30分钟或45分钟。

9.根据权利要求1或2所述的一种抑制黑化反应、低内毒素的家蚕血淋巴液的制备方法，其特征在于：所述步骤6）中水浴时间为30分钟或45分钟。

技术总结
本发明公开了一种抑制黑化反应、低内毒素的家蚕血淋巴液的制备方法，经过下述步骤：低内毒素蚕品种选取、蚕体消毒及杂质去除、蚕体低温麻醉、血淋巴液的收集、抗黑化处理、酚氧化酶灭活处理、去沉淀及无氧保存，最终得到抑制黑化反应、低内毒素的家蚕血淋巴液；针对现有技术提取的家蚕血淋巴液中含有大量内毒素，对细胞体外培养极为不利，也是制约昆虫血淋巴液取代胎牛血清的瓶颈之一，本发明能够减少家蚕淋巴液中的内毒素浓度；针对黑化反应而产生的醌衍生物所产生的问题，本发明能够降低家蚕血淋巴液中的酚氧化酶原活性，长期抑制血淋巴液的黑化反应，减少有毒醌的积累，使制备的家蚕血淋巴液能用于体外细胞的长期培养。

技术研发人员：任建宇,刘玲,柯皓天,程明,郑丹,杨旭超,刘禹豪,陈佳月,黄晨志
受保护的技术使用者：四川省丝绸科学研究院有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12