一种高亲和力结合TET(X)家族蛋白保守区的单克隆抗体及其应用的制作方法

本发明属于单克隆抗体，尤其涉及一种高亲和力结合tet(x)家族蛋白保守区的单克隆抗体及其应用。

背景技术：

1、替加环素是第三代四环素家族的抗生素成员，常用于治疗耐碳青霉稀类多重耐药的革兰阴性菌，被认为是抗生素的“最后一道防线”。tet(x)家族是一类单加氧酶，目前已发现有14个成员，tet(x)家族成员之间的氨基酸序列相似性可高达80％。tet(x)家族不仅对四环素家族的全部抗生素具有较强的水解活性，而且是近年来发现了可以通过质粒转移的tet(x)家族成员基因，这可能会造成此基因在临床细菌建播撒及替加环素抗性的蔓延，导致临床细菌耐药性形势发生恶化。tet(x2)是tet(x)家族中最早发现的成员之一，最早发现于黄杆菌科细菌的固有染色体基因组中。目前学术界认为后来发现tet(x)家族的成员可能是由tet(x2)进化而来。因此在临床上快速检测临床菌株的tet(x2)对于临床抗生素用药及细菌耐药性的防控具有重要意义。

2、目前，临床微生物实验室细菌耐药性的常规检测方法多为肉汤微量稀释法、纸片法等，存在耗时长的缺点。因此，细菌耐药性快速检测新技术的研发已成为检验与临床关注的焦点。针对病原微生物耐药性的快速检测方法不断涌现，如：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术(maldi-tofms)，光谱技术，电化学生物传感器，综合性分子诊断平台，宏基因组测序等等。虽耗时短，但是这些方法存在费用高昂，且对仪器设备及操作者要求过高的问题，因此，尚不容易普及，也难以及时指导抗感染治疗。

3、相比之下，基于抗原-抗体反应的快速检测方法因具有敏感性高、特异性好，且检测成本相对较低、对设备和操作者的技术要求相对较低等优点，目前已经在临床上广泛应用，但是目前尚未有将该方法应用于tet(x)蛋白检测中的相关报道。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，本发明提供了一种高亲和力结合tet(x)家族蛋白保守区的单克隆抗体及其应用。本发明首先人工合成核苷酸序列如seq id no.1所示，氨基酸序列如seq id no.2所示的截短型tet(x)抗原，然后诱导、表达、纯化获得抗原蛋白，接着使用该抗原蛋白进行动物免疫，最终获得重链fd段核苷酸序列如seq id no.9所示，氨基酸序列如seq id no.17所示，轻链核苷酸序列如seq id no.10所示，氨基酸序列如seq id no.18所示的单克隆抗体。本发明中的单抗与tet(x2)蛋白亲和力值高达1.5×10-10nm，可有效应用于替加环素抗药性的快速检测中。

2、为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

3、本发明提供了一种高亲和力结合tet(x)家族蛋白保守区的单克隆抗体，所述重链可变区包含cdr1、cdr2、cdr3，其中cdr1的核苷酸序列如seq id no.3所示，氨基酸序列如seq id no.11所示；cdr2的核苷酸序列如seq id no.4所示，氨基酸序列如seq id no.12所示；cdr3的核苷酸序列如seq id no.5所示，氨基酸序列如seq id no.13所示；所述轻链可变区包含cdr1、cdr2、cdr3，其中cdr1的核苷酸序列如seq id no.6所示，氨基酸序列如seqid no.14所示；cdr2的核苷酸序列如seq id no.7所示，氨基酸序列如seq id no.15所示；cdr3的核苷酸序列如seq id no.8所示，氨基酸序列如seq id no.16所示。

4、优选的，所述单克隆抗体重链fd段的核苷酸序列如seq id no.9所示，氨基酸序列如seq id no.17所示；所述单克隆抗体轻链的核苷酸序列如seq id no.10所示，氨基酸序列如seq id no.18所示。

5、本发明还提供了一种扩增所述单克隆抗体的引物组合，其中所述重链fd段上游引物的核苷酸序列如seq id no.19所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.20所示；所述轻链上游引物的核苷酸序列如seq id no.21所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.22所示。

6、本发明还提供了一种包含所述单克隆抗体或所述引物组合的试剂盒。

7、本发明还提供了一种与所述单克隆抗体特异性结合的截短型抗原，其核苷酸序列如seq id no.1所示，氨基酸序列如seq id no.2所示。

8、本发明还提供了一种所述单克隆抗体或所述引物组合或所述试剂盒或所述截短型抗原在tet(x)蛋白检测中的应用。

9、本发明还提供了一种所述单克隆抗体或所述引物组合或所述试剂盒或所述截短型抗原在替加环素耐药性检测中的应用。

10、与现有技术相比，本发明具有如下技术效果：

11、本发明中基于抗原-抗体反应的快速检测方法不仅具有敏感性高、特异性好、检测成本低、对设备和操作者的技术要求低等优点，而且本发明中的单克隆抗体与tet(x2)蛋白亲和力值还高达1.5×10-10nm，亲和力十分高，可有效应用于替加环素抗药性的快速检测中。

技术特征：

1.一种高亲和力结合tet(x)家族蛋白保守区的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体包含重链可变区和轻链可变区；

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述重链fd段的核苷酸序列如seqidno.9所示，氨基酸序列如seqidno.17所示；所述轻链的核苷酸序列如seqidno.10所示，氨基酸序列如seqidno.18所示。

3.一种扩增权利要求2所述的单克隆抗体的引物组合，其特征在于，所述重链fd段上游引物的核苷酸序列如seqidno.19所示，下游引物的核苷酸序列如seqidno.20所示；所述轻链上游引物的核苷酸序列如seqidno.21所示，下游引物的核苷酸序列如seqidno.22所示。

4.一种包含权利要求1~2任一所述的单克隆抗体或权利要求3所述的引物组合的试剂盒。

5.一种与权利要求1~2任一所述的单克隆抗体特异性结合的截短型抗原，其特征在于，其核苷酸序列如seqidno.1所示，氨基酸序列如seqidno.2所示。

6.权利要求1~2任一所述的单克隆抗体或权利要求3所述的引物组合或权利要求4所述的试剂盒或权利要求5所述的截短型抗原在tet(x)蛋白检测中的应用。

7.权利要求1~2任一所述的单克隆抗体或权利要求3所述的引物组合或权利要求4所述的试剂盒或权利要求5所述的截短型抗原在替加环素耐药性检测中的应用。

技术总结
本发明提供了一种高亲和力结合TET(X)家族蛋白保守区的单克隆抗体及其应用，属于单克隆抗体技术领域。本发明首先人工合成核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的截短型TET(X)抗原，然后诱导、表达、纯化获得抗原蛋白，接着使用该抗原蛋白进行动物免疫，最终获得重链Fd段核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示，轻链核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示的单克隆抗体。本发明中的单抗与TET(X)蛋白亲和力值高达1.5×10<supgt;‑10</supgt;nM，可有效应用于替加环素抗药性的快速检测中。

技术研发人员：王和平,王文建,李莉,胡倩,禹定乐
受保护的技术使用者：深圳市儿童医院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13