新型冠状病毒重组蛋白的制备方法与流程

本发明涉及疫苗发酵，特别涉及新型冠状病毒重组蛋白的制备方法。

背景技术：

1、冠状病毒已知可引起感冒及中东呼吸综合征和严重急性呼吸综合征等较严重疾病，新型冠状病毒是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株，人感染了冠状病毒后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等，在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡；新型冠状病毒肺炎主要以对症治疗为主，疫苗防御为辅；目前市面上存在的主要疫苗尚存在保护率不高、无法应对病毒突变株等缺陷，新型冠状病毒疫苗研发技术路线总体可分为3类：第1类是经典的技术路线；第2大类是以病毒遗传物质为主的病毒载体疫苗；第3大类是通过基因工程的手段表达出的病毒蛋白抗原，包括亚单位疫苗和病毒样颗粒疫苗，目前重组亚单位疫苗和vlps疫苗主要选择的表达载体为vero细胞，存在相对较高的培养成本、易被微生物污染、杂蛋白种类多分离困难、目的蛋白含量较低等缺点。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了新型冠状病毒重组蛋白的制备方法，具备培养成本低、蛋白产量高、批间稳定性好、培养周期短、杂蛋白少便于后续处理的优点。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了新型冠状病毒重组蛋白的制备方法，包括如下步骤：

4、步骤(1)：将elabela信号肽和新型冠状病毒s-rbd蛋白的编码基因导入到毕赤酵母中，获得毕赤酵母重组菌株；

5、步骤(2)：对步骤(1)所述毕赤酵母重组菌株进行单克隆挑取，培养，冻存，获得毕赤酵母工程菌种子；

6、步骤(3)：取步骤(2)所述毕赤酵母工程菌种子，接入培养液活化，至培养液od600达到4.0～7.0，获得活化液；对所述活化液进行培养，至活化液od600达到6.0～9.0，获得发酵液i；

7、步骤(4)：取步骤(3)所述发酵液i与基础盐培养基bsm混合，发酵至菌体湿重达到120～160g/l，与诱导剂混合，诱导，获得发酵液ii；

8、步骤(5)：取步骤(4)所述发酵液ii进行离心，收集上清液，获得所述新型冠状病毒重组蛋白。

9、在本发明的一些具体实施方案中，上述制备方法的所述elabela信号肽和新型冠状病毒s-rbd蛋白的编码基因具有如seq id no.1所示的核苷酸序列；和/或

10、所述elabela信号肽和新型冠状病毒s-rbd蛋白具有如seq id no.2所示的氨基酸序列。

11、在本发明的一些具体实施方案中，上述制备方法步骤(3)中所述接入包括取200μl所述毕赤酵母工程菌种子接入20ml所述培养基；和/或

12、所述培养基包括ypd培养基；和/或

13、所述活化的转速为160～180r/min；和/或

14、所述活化的温度为30～32℃；和/或

15、所述活化的时间为18～30h。

16、在本发明的一些具体实施方案中，上述制备方法步骤(3)中所述培养包括取2～5ml所述活化液接入200～500ml ypd培养基的步骤；和/或

17、所述培养的转速为180r/min；和/或

18、所述培养的温度为30℃；和/或

19、所述培养的时间为18～30h。

20、在本发明的一些具体实施方案中，上述制备方法步骤(4)中5l所述基础盐培养基bsm的制备方法包括：将2.0～3.0g的k2so4、8.0～12.0g的mgso4、0.5～1.0g的caso4、20.0～25.0g的磷酸二氢铵、1～2ml的h3po4、2～3g的koh、200～250g的甘油、20～30ml的ptm1和0.5～1.0ml的消泡剂混合，加去离子水定容至5l，使用磷酸调节ph至4.5～5.0；和/或

21、所述h3po4包括85％浓磷酸；和/或

22、所述消泡剂包括sigma生产的antifoam；和/或

23、所述ptm1的制备方法包括：称取硫酸铜6.0g、碘化钾0.09g、硫酸锰3.0g、钼酸钠二水0.2g、硼酸0.02g、氯化钴0.5g、氯化锌20g、硫酸亚铁65g和硫酸5.0ml，加水定容至1000ml，0.22μm滤膜过滤除菌；和/或

24、所述硫酸铜包括五水合硫酸铜(ii)；和/或

25、所述硫酸锰包括一水合硫酸锰；和/或

26、所述氯化钴包括六水合氯化钴；和/或

27、所述硫酸亚铁包括七水合硫酸亚铁。

28、在本发明的一些具体实施方案中，上述制备方法步骤(4)中所述发酵液i与所述基础盐培养基bsm的体积比为1:15～1:7.5；或

29、步骤(4)中所述基础盐培养基bsm的体积为5l，且所述发酵液i的体积为333ml～667ml。

30、在本发明的一些具体实施方案中，上述制备方法步骤(4)中所述发酵的温度为29.0～30.0℃；和/或

31、所述发酵的初始ph为5.0～5.3；和/或

32、所述发酵的起始转速为200rpm；和/或

33、所述发酵的溶解氧为10％～50％；和/或

34、所述发酵的时间为16～20小时。

35、在本发明的一些具体实施方案中，上述制备方法步骤(4)中所述诱导包括：以2.0～4.0g/l/h的补料速率流加诱导剂；和/或

36、所述诱导的溶解氧为10％～50％；和/或

37、所述诱导剂包括甲醇或甲醇与甘油的混合物；和/或

38、所述诱导的时间为48～72小时。

39、在本发明的一些具体实施方案中，上述制备方法步骤(5)中所述离心的转速为5000rpm；和/或

40、所述新型冠状病毒重组蛋白包括新型冠状病毒s-rbd蛋白。

41、本发明还提供了抗原蛋白，其编码基因具有如seq id no.1所示的核苷酸序列。

42、本发明还提供了上述制备方法制得的所述新型冠状病毒重组蛋白或上述抗原蛋白在制备新型冠状病毒疫苗中的应用。

43、本发明的方法有如下效果：

44、本发明具备培养成本低、蛋白产量高、批间稳定性好、培养周期短、杂蛋白少便于后续处理的优点；同时本发明在前期对毕赤酵母插入的基因序列和培养中，能够使得毕赤酵母的整体质量得到提升，有益于后期成品的质量。

技术特征：

1.新型冠状病毒重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述elabela信号肽和新型冠状病毒s-rbd蛋白的编码基因具有如seq id no.1所示的核苷酸序列；和/或

3.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述接入包括取200μl所述毕赤酵母工程菌种子接入20ml所述培养基；和/或

4.如权利要求1至3任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述培养包括取2～5ml所述活化液接入200～500ml ypd培养基的步骤；和/或

5.如权利要求1至4任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中5l所述基础盐培养基bsm的制备方法包括：将2.0～3.0g的k2so4、8.0～12.0g的mgso4、0.5～1.0g的caso4、20.0～25.0g的磷酸二氢铵、1～2ml的h3po4、2～3g的koh、200～250g的甘油、20～30ml的ptm1和0.5～1.0ml的消泡剂混合，加去离子水定容至5l，使用磷酸调节ph至4.5～5.0；和/或

6.如权利要求1至5任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述发酵液i与所述基础盐培养基bsm的体积比为1:15～1:7.5；或

7.如权利要求1至6任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述发酵的温度为29.0～30.0℃；和/或

8.如权利要求1至7任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述诱导包括：以2.0～4.0g/l/h的补料速率流加诱导剂；和/或

9.如权利要求1至8任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中所述离心的转速为5000rpm；和/或

技术总结
本发明涉及疫苗发酵技术领域，特别涉及新型冠状病毒重组蛋白的制备方法。本发明将ELABELA信号肽和新型冠状病毒抗原spike‑RBD蛋白基因的DNA序列导入毕赤酵母，诱导培养，纯化，获得毕赤酵母重组菌株和新型冠状病毒重组蛋白。本发明具备培养成本低、蛋白产量高、批间稳定性好、培养周期短、杂蛋白少便于后续处理的优点；同时本发明在前期对毕赤酵母插入的基因序列以及培养中，能够使得毕赤酵母的整体质量得到提升，有益于后期成品的质量。

技术研发人员：叶春辉,张浩,杨文魁,郭海凤,王海生,姚时,沈佳恬
受保护的技术使用者：长春卓谊生物股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/11