一种鲐鱼暗色肉酶解抗菌肽及其制备方法和用途

本发明涉及广谱性抗菌肽制备技术，尤其是涉及一种鲐鱼暗色肉酶解抗菌肽及其制备方法和用途。

背景技术：

1、抗菌肽作为一种新型生物防腐剂，具有绿色、安全、高效等特点。抗菌肽一般来源于微生物代谢产物、动物口腔分泌物、动物蛋白水解产物等。然而目前具有商业价值的抗菌肽如溶菌酶、乳酸链球菌素、纳他霉素等，对于革兰氏阳性菌抑制效果远高于革兰氏阴性菌。而水产食品的优势腐败菌却是腐败希瓦氏菌、假单胞菌、黄杆菌等的革兰氏阴性菌。为此，开发商品化的水产食品抗菌肽非常有必要，而碳端或氮端为赖氨酸、精氨酸等碱性氨基酸的寡肽对革兰氏阴性菌具有良好的抑菌效果。

2、海洋中上层鱼肌肉富含赖氨酸、精氨酸、组氨酸等碱性氨基酸。苏阳等对《南海产3种金枪鱼普通肉、暗色肉营养成分分析与评价》表明，在去除肌肉中的脂肪、多糖等后，暗色肉中碱性氨基酸比例显著高于普通肉。而暗色肉通常又是加工的下脚料，仅作为饲料鱼粉加工的原料，附加值低。以海洋中上层鱼加工下脚料制备绿色、安全、高效的生物抗菌肽，其商业前景广阔。目前，国内外还没有公开任何关于鲐鱼暗色肉酶解抗菌肽及其制备方法和应用的相关研究报道。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是提供一种提取效率高，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌均有显著的抑制作用的鲐鱼暗色肉酶解抗菌肽及其制备方法和用途。

2、本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种鲐鱼暗色肉酶解抗菌肽，所述的抗菌肽氨基酸序列为arg-ser-cys-his（rsch）和/或lys-ser-cys-gly（kscg）。

3、上述鲐鱼暗色肉酶解抗菌肽的制备方法，步骤如下：

4、（1）脱脂鲐鱼暗色肉的制备

5、将鲐鱼于100 ℃蒸煮20 min后去离子水喷淋冷却至40-50 ℃，取鱼背部色泽较深暗色肉，于匀浆机中处理3～4 min后，加入与鱼肉等质量的异丙醇，50 ℃下脱脂90 min，真空抽滤得到脱脂鲐鱼暗色肉；

6、（2）非定向内切酶的双酶水解

7、将步骤（1）得到的脱脂鲐鱼暗色肉中加入鱼肉质量2～4倍的去离子水，用naoh调ph至7～11，然后加入胰蛋白酶和地衣芽孢杆菌蛋白酶，于43-47℃下酶解4 h，接着升温至90 ℃以上，保温灭酶20 min，于6500 r/min转速离心10 min，取上清液即得酶解粗液；首先以胰蛋白酶和地衣芽孢杆菌蛋白酶进行双酶水解，这两种酶均可高效的降解鲐鱼暗色肉，且双酶协同解酶可大幅度提高水解度。这是因为鲐鱼蛋白中含有较多的碱性氨基酸，在胰蛋白酶的活性中心有天冬氨酸，有利于与带正电性的精氨酸和赖氨酸结合，而地衣芽孢杆菌蛋白酶属于极性带正电荷的氨基酸，因此鱼肉蛋白质经地衣芽孢杆菌蛋白酶水解后，为胰蛋白酶提供了更加多的作用位点,大大提高了酶解效果，使鲐鱼暗色肉寡肽的提取率提高到95 %以上；

8、（3）定向内切酶的双酶水解

9、将步骤（2）得到的酶解粗液中加入c端内切双酶半胱氨酸蛋白酶argc和丝氨酸蛋白酶lysc，于43-47℃下酶解4 h，接着升温至90 ℃以上，保温20 min灭酶， 5000 r/min 离心15min，得上层酶解清液；接着通过c端内切双酶为半胱氨酸蛋白酶argc和丝氨酸蛋白酶lysc酶解，可以高效、特异地切割精氨酸和赖氨酸的c端，由于赖氨酸和精氨酸在蛋白质序列中分布较广，蛋白质样品酶解后可产生平均长度为14个氨基酸残基并以碱性氨基酸结尾的肽段，这些肽段的羧基端的赖氨酸或精氨酸残基上以及氨基端分别带有一个正电荷，大大提高了其抗菌活性；

10、（4）抗菌肽的收集

11、将步骤（3）得到的上层酶解清液，用超滤系统过滤获得分子量1-3 kda的酶解液，收集滤液后冷冻干燥，粉末即为鲐鱼暗色肉酶解抗菌肽，所述的抗菌肽氨基酸序列为arg-ser-cys-his（rsch）和/或lys-ser-cys-gly（kscg）。

12、进一步，步骤（2）中所述的胰蛋白酶和所述的地衣芽孢杆菌蛋白酶的用量分别为1000～3000u/g。

13、进一步，步骤（3）中所述的半胱氨酸蛋白酶argc和所述的丝氨酸蛋白酶lysc的用量分别为1000～3000 u/g。

14、上述鲐鱼暗色肉酶解抗菌肽在制备抗菌剂方面的用途，所述的菌种包括肠杆菌、腐败希瓦氏菌、假单胞菌、乳酸菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌。

15、与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明公开了一种鲐鱼暗色肉酶解抗菌肽及其制备方法，其制备方法包括脱脂鲐鱼暗色肉的制备、非定向内切酶的双酶水解、定向内切酶的双酶水解及抗菌肽的收集等。所得的鲐鱼暗色肉抗菌肽具有广谱性，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌均有显著的抑制作用。对肠杆菌（ enterobacteriaceae）、腐败希瓦氏菌（ shewanella putrefaciens）、假单胞菌（ pseudomonas spp.）的 mic 值为 10 ug/ml，对乳酸菌( lactobacillus) 的 mic 值为 20 ug/ml，对金黄色葡萄球菌（ staphylococcus  aureus ）和枯草芽孢杆菌（ staphylococcus aureus ）的 mic 值为 80 ug/ml，是一种绿色、安全、高效的广谱性抗菌肽。

技术特征：

1.一种鲐鱼暗色肉酶解抗菌肽，其特征在于：所述的抗菌肽氨基酸序列为arg-ser-cys-his和/或lys-ser-cys-gly。

2.一种权利要求1所述的鲐鱼暗色肉酶解抗菌肽的制备方法，其特征在于步骤如下：

3.根据权利要求2所述的一种鲐鱼暗色肉酶解抗菌肽的制备方法，其特征在于：步骤（2）中所述的胰蛋白酶和所述的地衣芽孢杆菌蛋白酶的用量分别为1000～3000u/g。

4.根据权利要求2所述的一种鲐鱼暗色肉酶解抗菌肽的制备方法，其特征在于：步骤（3）中所述的半胱氨酸蛋白酶argc和所述的丝氨酸蛋白酶lysc的用量分别为1000～3000u/g。

5.一种权利要求1所述的鲐鱼暗色肉酶解抗菌肽在制备抗菌剂方面的用途，其特征在于所述的抗菌剂包括肠杆菌抗菌剂、腐败希瓦氏菌抗菌剂、假单胞菌抗菌剂、乳酸菌抗菌剂、金黄色葡萄球菌抗菌剂和枯草芽孢杆菌抗菌剂。

技术总结
本发明公开一种鲐鱼暗色肉酶解抗菌肽及其制备方法和用途，特点是该抗菌肽氨基酸序列为Arg‑Ser‑Cys‑His和/或Lys‑Ser‑Cys‑Gly，其制备方法步骤如下：将脱脂鲐鱼暗色肉中加入鱼肉质量2～4倍的去离子水pH至7～11，然后加入胰蛋白酶和地衣芽孢杆菌蛋白酶酶解，接着保温灭酶后离心，取上清液即得酶解粗液；将酶解粗液中加入C端内切双酶半胱氨酸蛋白酶ArgC和丝氨酸蛋白酶LysC酶解，保温灭酶后离心，得上层酶解清液，然后用超滤系统过滤获1‑3 kDa的酶解液，收集滤液后冷冻干燥，粉末即为鲐鱼暗色肉酶解抗菌肽，优点是提取效率高，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌均有显著的抑制作用。

技术研发人员：程永发,付世骞,林邦楚,李勇勇,王玥,王晴,刘梦晴,李玉霜,莫雨珂,娄永江
受保护的技术使用者：宁波大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13