检测T7RNA聚合酶活性的方法与流程

本发明涉及生物，特别是涉及检测t7 rna聚合酶活性的方法。

背景技术：

1、t7 rna聚合酶，(t7 rna polymerase)是一种高度特异识别t7启动子序列的dna依赖的5'→3'rna聚合酶。t7 rna polymerase以含有t7启动子序列的单链或双链dna为模板，ntp为底物，合成与启动子下游的单链dna或双链dna模板链互补的rna。t7 rna polymerase可以识别修饰的ntp，例如生物素标记、地高辛标记、荧光素标记的ntp，可以用于各种标记rna的合成。同时对于t7启动子有高度的特异性。t7是启动子(t7 promoter)，来自t7噬菌体，能够对t7 rna聚合酶有特异性反应的强启动子，是启动t7噬菌体基因转录的一段序列。t7 rna聚合酶具有高度启动子专一性，且只会转录t7噬菌体中位于t7启动子下游的的dna或dna复制品。t7 rna聚合酶能选择性的激活t7噬菌体启动子的转录，其合成mrna的速度比普通大肠杆菌的rna聚合酶快5倍左右。

2、pepper序列为rna分子片段，可高度特异结合不发光的染料分子，进而产生强烈荧光。这些荧光rna的颜色与辣椒类似，它们具有蓝绿色、黄色、橙色及红色等不同颜色，因此被命名为pepper。进一步的结果表明，pepper是以单体且非g四链体的结构形式与染料分子结合，且有着纳摩尔级的高亲和力，高温度稳定性、强ph耐受性，以及对外源序列融合插入的高度兼容性。pepper的这些优良性质使得它在细胞中的荧光亮度、激活倍数要比现有的最好的拟荧光蛋白rna高出至少一个数量级，亲和力与稳定性高出两到三个数量级

3、虽然荧光原位杂交技术，或是酶反应催化的rna化学共价标记技术均可用来标记rna，但这些技术目前只能用于固定化细胞亦即死细胞的研究，不适合对活细胞内rna进行分析。近期，关于利用pepper研究rna的技术正在兴起，但是如何利用pepper序列研究酶的活性尚未出现相关报道。

技术实现思路

1、鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种检测t7 rna聚合酶活性的方法，提供了一种全新的检测方法。

2、本发明的一方面提供了t7 rna聚合酶活性的检测方法，所述方法为利用t7 rna聚合酶催化合成含有pepper的rna链，将rna链与荧光染料结合，通过检测荧光强度计算t7rna聚合酶的活性。

3、荧光染料可以与pepper序列特异性结合，产生荧光，通过检测荧光的强度，检测合成的pepper的量，生产pepper的量又与t7 rna聚合酶的活性成正比，进而可以判定t7 rna聚合酶的活性。

4、进一步地，所述荧光染料为hbc。例如hbc530。

5、进一步地，所述pepper的核苷酸序列为ccaatcgtggcgtgtcggcctgcttcggcaggcactggcgccg。

6、进一步地，所述合成rna链使用的引物核苷酸序列分别如seq id no.3和seq idno.4所示。

7、进一步地，所述方法具体为：

8、(1)以含有t7启动子和pepper的引物dna进行双引物退火,得到的产物作为模板；

9、(2)将退火产物，在a/u/c/gtp存在的条件下被t7 rna聚合酶转录,转录合成带有pepper的rna链；

10、(3)以t7 rna聚合酶活力的log值为横坐标,荧光强度为纵坐标,用做非线性回归曲线并计算ec50；即可计算t7 rna聚合酶活力。

11、进一步地，所述退火的条件如表2。

12、进一步地，所述转录程序时间为30～60min，温度为30～45℃。

13、进一步地，所述方法具体为：

14、(1)以含有t7启动子和pepper的引物dna进行双引物退火,得到的产物作为模板；

15、(2)将退火产物，在a/u/c/gtp存在的条件下被t7 rna聚合酶转录,转录合成带有pepper的rna链；

16、(3)以标准样本t7 rna聚合酶活力的ln值为横坐标，荧光强度为纵坐标，添加指数趋势线，得到指数函数，以此作为标准曲线，将待测样本测试得到荧光值代入标准曲线中，进行计算酶活力。

17、进一步地，所述转录程序时间为30～60min，温度为30～45℃。

18、本发明的另一方面提供了一种用于检测t7 rna聚合酶活性的试剂盒，所述试剂盒包含转录程序所需的一般反应试剂，核苷酸序列分别如seq id no.3和seq id no.4所示的引物，以及荧光染料。

19、进一步地，所述荧光染料为hbc，例如hbc530。

20、进一步地，所述试剂盒中含有转录程序所需的一般反应试剂，例如rntp、10×t7rna polymerase buffer、dtt。

21、如上所述，本发明的检测t7 rna聚合酶活性的方法，具有以下有益效果：

22、本方法操作简单、周期短且成本低，同时具备高灵敏度和准确性,对于实现t7rna聚合酶活性的高通量、自动化检测具有重要意义

技术特征：

1.一种检测t7 rna聚合酶活性的方法，所述方法为利用t7 rna聚合酶催化合成含有pepper的rna链，将rna链与荧光染料结合，通过检测荧光强度计算t7 rna聚合酶的活性。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述荧光染料为hbc。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述pepper的核苷酸序列为ccaatcgtggcgtgtcggcctgcttcggcaggcactggcgccg。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述合成rna链使用的引物核苷酸序列分别如seq id no.3和seq id no.4所示。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具体为：

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述退火的条件如表2，所述转录反应时间为30～60min，温度为30～45℃。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具体为：

8.一种用于检测t7 rna聚合酶的活性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含核苷酸序列分别如seq id no.3和seq id no.4所示的引物，以及荧光染料。

9.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述荧光染料为hbc。

10.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有转录程序所需试剂。

技术总结
本发明提供一种检测T7RNA聚合酶活性的方法，所述方法为利用T7RNA聚合酶催化合成含有pepper的RNA链，将RNA链与荧光染料结合，通过检测荧光强度计算待测T7RNA聚合酶的活性。本方法检测T7RNA聚合酶活性方便快捷且精准度高。

技术研发人员：杨弋,杨菁,唐双,蔡元
受保护的技术使用者：常州福洛森医疗科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13