辣椒CMS恢复基因分子标记引物对及其应用

本发明涉及生物技术辅助育种，具体涉及辣椒cms恢复基因分子标记引物对及其应用。

背景技术：

1、辣椒是我国种植面积和产值第一大蔬菜作物，开发与辣椒胞质雄性不育(cms)恢复基因紧密连锁标记有助于缩短育种过程。然而，目前辣椒恢复基因还不明确，多数认为辣椒cms恢复基因由一个显性基因控制的，也有认为它与一个主qtl和四个小qtl与辣椒的育性恢复有关，也有报道认为它由两个主加性-显性上位基因和一个加性-显性多基因，此外，cms表型可以在低温下暂时恢复，这表明温度会影响一些育性修饰基因的表达。辣椒cms/rf系统的作用机制比较复杂，辣椒基因组中可能存在多个rf基因，不同的恢复系具有基因型特异性rf基因。针对辣椒rf基因前人已经开发了多种类型的分子标记用于辅助育种，其中标记crf-scar在不同自然群体中对育性恢复性状的准确率最高，分别为89.1％、79.2％和100％。可能由于不育源、恢复源不同或存在多个rf基因，在我们前期的研究中发现，crf-scar标记不能区分广西壮族自治区农业科学院蔬菜研究所自主选育的辣椒不育系014a和辣椒恢复系014ccms分离群体的可育和不育材料。现有技术中的标记还存在通用性差，准确度低的技术问题，因此，筛选研究出准确度更高的恢复基因相关的分子标记，以鉴别辣椒cms分离群体中纯合可育子代、杂合可育子代或不育子代，为获得相应的“三系”品种奠定基础，对于后期的育种工作尤为重要。

技术实现思路

1、本发明克服了现有技术中的分子标记不能有效区分辣椒不育系014a和辣椒恢复系014ccms分离群体的可育和不育材料，准确率低，不利于辣椒育种工作的开展的的技术问题，提供辣椒cms恢复基因分子标记引物对及其应用。

2、为解决上述问题，本发明采取如下技术方案：

3、辣椒cms恢复基因分子标记引物对，所述分子标记引物对为引物对op59或引物对pp5，所述引物对op59的上游序列如seq id no：1所示，下游序列如seq id no：2所示；所述引物对pp5的上游序列如seq id no：3所示，下游序列如seq id no：4所示。

4、本发明的另一个目的在于保护上述引物对op59在鉴别辣椒cms分离群体中纯合可育子代上的应用。对应的，纯合可育子代的细胞核内恢复基因的基因型为rfrf，引物对op59可以鉴别辣椒cms分离群体中单株细胞核内恢复基因的基因型为rfrf的植株。

5、本发明的另一个目的在于保护上述引物对op59在鉴别辣椒cms分离群体中纯合可育子代、杂合可育子代或不育子代中的应用。对应的，纯合可育子代的细胞核内恢复基因的基因型为rfrf，杂合可育子代的细胞核内恢复基因的基因型rfrf、不育子代的细胞核内恢复基因的基因型是rfrf，因而本发明可以鉴别辣椒cms分离群体单株细胞核内恢复基因的基因型。

6、其中，引物对op59或引物对pp5在鉴定辣椒不育系014a和辣椒恢复系014c的cms分离群体中准确率高。

7、应用上述辣椒cms恢复基因分子标记引物对鉴定cms分离群体的方法，其包括如下步骤：

8、(1)以辣椒胞质雄性不育系和恢复系为亲本构建f2分离群体；

9、(2)提取f2分离群体的基因组dna；

10、(3)利用引物对op59进行pcr扩增，当扩增出282bp片段时，即判定该辣椒植株为纯合可育，当扩增出278bp时，即判定该辣椒植株为不育；当扩增出282bp、278bp双条带时则判定该辣椒植株为杂合可育；

11、或

12、(4)利用引物对pp5进行pcr扩增，当扩增无条带时，即判定该辣椒植株为纯合可育；当扩增出条带时，即判定该辣椒植株为不育或杂合可育。

13、其中，所述pcr反应总体系为10μl，其中50ng/μl模版dna1μl、taqdna聚合酶5μl、10μmol/l的上下游引物各0.5μl、ddh2o3μl。

14、其中，所述pcr扩增程序为95℃预变性3min；95℃变性30s，50.5℃退火30s，72℃延伸30s，28个循环；72℃延伸10min；4℃保存。

15、其中，所述引物对op59pcr扩增出的278bp片段序列如seq id no：5或seq id no：6所示，扩增出的282bp片段序列如seq id no：7或seq id no：8所示。

16、本发明与现有技术相比较具有以下有益效果：

17、本发明能利用引物对op59对辣椒不育系和辣椒恢复系的cms分离群体进行pcr扩增，当扩增出282bp片段，可判定该辣椒植株为纯合可育；当扩增出278bp时，可判定该辣椒植株为不育；当扩增出双条带时，则可判定该辣椒植株为杂合可育。本发明还能利用引物对pp5对辣椒不育系和辣椒恢复系的cms分离群体进行pcr扩增，当扩增无条带时，即判定该辣椒植株为纯合可育；当扩增出条带时，即判定该辣椒植株为不育或杂合可育。本发明的两条引物对在不育系014a和恢复系014c的cms分离群体中验证，引物对op59在不育的群体中准确率为100％，在可育单株中准确率为97.21％。引物对pp5在不育单株和纯合可育单株中准确率均为100％，本发明的鉴定方法准确度高，本发明的分子标记引物能对有效鉴定不育系和恢复系的cms分离群体中可育和不可育材料，能鉴定辣椒cms分离群体中细胞核内恢复基因的基因型，对后期育种工作具有重大的价值，应用在辣椒细胞核内恢复基因的基因型的鉴定，对辣椒的育种提供很大帮助，为分子标记辅助选育辣椒“三系”品种奠定了基础。

技术特征：

1.辣椒cms恢复基因分子标记引物对，其特征在于，所述分子标记引物对为引物对op59或引物对pp5，所述引物对op59的上游序列如seq id no：1所示，下游序列如seq id no：2所示；所述引物对pp5的上游序列如seq id no：3所示，下游序列如seq id no：4所示。

2.权利要求1所述引物对pp5在鉴别辣椒cms分离群体中纯合可育子代上的应用。

3.权利要求1所述引物对op59在鉴别辣椒cms分离群体中纯合可育子代、杂合可育子代或不育子代中的应用。

4.应用如权利要求1所述的辣椒cms恢复基因分子标记引物对鉴定cms分离群体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述辣椒胞质雄性不育系为014a和辣椒恢复系为014c。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述pcr反应总体系为10μl，其中50ng/μl模版dna1μl、taqdna聚合酶5μl、10μmol/l的上下游引物各0.5μl、ddh2o 3μl。

7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述pcr扩增程序为95℃预变性3min；95℃变性30s，50.5℃退火30s，72℃延伸30s，28个循环；72℃延伸10min；4℃保存。

8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述引物对op59 pcr扩增出的278bp片段序列如seq id no：5或seq id no：6所示，扩增出的282bp片段序列如seq id no：7或seq idno：8所示。

技术总结
本发明公开了辣椒CMS恢复基因分子标记引物对及其应用，分子标记引物对为引物对OP59或引物对PP5，引物对OP59的上游序列如SEQ ID NO：1所示，下游序列如SEQ ID NO：2所示；引物对PP5的上游序列如SEQ ID NO：3所示，下游序列如SEQ ID NO：4所示。经验证，本发明的两个分子标记引物能有效鉴定不育系014A和恢复系014C及其杂交后代细胞核内恢复基因的基因型，引物对OP59在不育的群体中准确率为100％，在可育单株中准确率为97.21％。引物对PP5在不育单株和纯合可育单株中准确率均为100％，本发明鉴定准确率高为分子标记辅助选育辣椒“三系”品种奠定了基础。

技术研发人员：王萌,赵虎,王日升,吴星,赵曾菁,龚明霞,何志
受保护的技术使用者：广西壮族自治区农业科学院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13