褐色绿僵菌IFST-OT3及其产生的脱毒酶与应用

本发明涉及微生物学及生物脱毒，具体地说，涉及一株褐色绿僵菌ifst-ot3及其产生的脱毒酶与应用。

背景技术：

1、赭曲霉毒素a(ota)是曲霉和青霉属真菌产生的次级代谢产物。1993年，国际癌症研究机构将ota列为2b类致癌物质。此外，研究证明ota具有肾毒性、神经毒性、免疫毒性等(malir,et al.,2016,toxins 8:191)。赭曲霉毒素b(otb)是ota的前体，其分子结构比ota少一个氯原子。ota和otb可污染玉米、小麦、高粱、水果、奶制品、肉制品等多种农产品(wang,et al.,2022,frontiers in microbiology,13:857726)，引起严重的食品安全问题。食品及饲料中ota会造成进出口贸易受阻、人畜医疗费用，造成巨大的经济损失。

2、采取多种方式脱除农产品中污染的ota是避免经济损失不可或缺的方式。目前，食品和饲料工业中主要通过物理、化学和生物的方法脱毒，其中生物脱毒具有安全、高效、无污染的特征，最具应用前景。生物脱毒方法可分为两类，一是基于微生物本身的吸附作用，二是微生物产生的代谢物，例如酶对ota的降解作用。自然界中广泛存在可降解ota的微生物资源，部分细菌对ota的降解率高达90％。解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)在24h内对ota降解率达到98.5％(chang et al.,2015,foodadditives&contaminants:part a,32,564-571)。分离自麋鹿粪便的枯草芽孢杆菌(b.subtilis)，在24h内对ota的降解率达到97.6％(shi,et al.,2014,journal of thescience of food and agriculture,94:1879-1885)。粪产碱菌(alcaligenes faecalis)48h内可降解97％的ota(zhang,et al.,2017,journal of applied microbiology,123:661-668)。

3、目前，挖掘生物脱毒酶及其编码基因，可实现ota的精准高效脱除，提高脱毒效果的稳定性，为生物解毒方法积累关键性的核心技术。目前，对于脱毒机制和毒素降解基因报道较少，亟需挖掘新的ota生物降解酶。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一株褐色绿僵菌metarhizium brunneum ifst-ot3及其在生物脱毒中的应用。

2、本发明的另一目的是提供由褐色绿僵菌ifst-ot3产生的脱毒酶及其应用。

3、为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供从土壤样品分离纯化获得的一株褐色绿僵菌metarhizium brunneum ifst-ot3，该菌现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号cgmcc no.40349，保藏日期2022年10月28日。

4、第二方面，本发明提供含有所述褐色绿僵菌ifst-ot3的菌剂。

5、第三方面，本发明提供所述褐色绿僵菌ifst-ot3或其菌剂在赭曲霉毒素a和b脱毒中的应用。

6、第四方面，本发明提供由所述褐色绿僵菌ifst-ot3产生的脱毒酶amh1，所述脱毒酶amh1包含如下的氨基酸序列或由其组成：

7、i)seq id no:1所示的氨基酸序列；或

8、ii)在i)的n端和/或c端连接标签得到的氨基酸序列；或

9、iii)i)或ii)的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的酶。

10、第五方面，本发明提供编码所述脱毒酶amh1的核酸分子，其核苷酸序列如seq idno:2所示。

11、第六方面，本发明提供含有所述核酸分子的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组dna、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系。

12、第七方面，本发明提供所述脱毒酶amh1的以下任一应用：

13、1)用于降解赭曲霉毒素a和b；

14、2)用于制备赭曲霉毒素a和b的脱毒剂。

15、第八方面，本发明提供赭曲霉毒素a的降解方法，在30-80℃，ph4.0-8.0的缓冲体系中，使所述脱毒酶amh1与赭曲霉毒素a接触。

16、优选地，体系中赭曲霉毒素a的浓度为1-5μg/ml。

17、优选地，脱毒酶amh1与赭曲霉毒素a的摩尔比为1:130。

18、本发明在原核表达系统(大肠杆菌)中实现了该脱毒酶的异源高表达，且对于赭曲霉毒素的降解效率极高。

19、借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

20、本发明提供一株对赭曲霉毒素a和b具有较强降解能力的褐色绿僵菌ifst-ot3，以及由其产生的脱毒酶(降解酶)以及编码该酰胺酶的核苷酸序列，还提供了该酶的最适理化特性，包括温度和ph。该酰胺酶在60℃，ph6.0的缓冲体系中处理底物浓度1μg/ml ota毒素，3min内降解效率高达100％。菌株ifst-ot3及由其产生的脱毒酶可用于农产品中赭曲霉毒素的降解，应用前景广阔。

技术特征：

1.褐色绿僵菌metarhizium brunneum ifst-ot3，其特征在于，保藏编号为cgmccno.40349。

2.含有权利要求1所述褐色绿僵菌ifst-ot3的菌剂。

3.权利要求1所述褐色绿僵菌ifst-ot3或其菌剂在赭曲霉毒素a和b脱毒中的应用。

4.由权利要求1所述褐色绿僵菌ifst-ot3产生的脱毒酶amh1，其特征在于，所述脱毒酶amh1包含如下的氨基酸序列或由其组成：

5.编码权利要求4所述脱毒酶amh1的核酸分子。

6.含有权利要求5所述核酸分子的生物材料，其特征在于，所述生物材料为重组dna、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系。

7.权利要求4所述脱毒酶的以下任一应用：

8.赭曲霉毒素a的降解方法，其特征在于，在30-80℃，ph4.0-8.0的缓冲体系中，使权利要求4所述脱毒酶amh1与赭曲霉毒素a接触。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，体系中赭曲霉毒素a的浓度为1-5μg/ml。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述脱毒酶amh1与赭曲霉毒素a的摩尔比为1:130。

技术总结
本发明提供一株褐色绿僵菌IFST‑OT3及其产生的脱毒酶与应用。本发明提供一株对赭曲霉毒素A和B具有较强降解能力的褐色绿僵菌IFST‑OT3(保藏编号CGMCCNo.40349)，以及由其产生的脱毒酶(降解酶)Amh1以及编码该酰胺酶的核苷酸序列，还提供了该酶的最适理化特性，包括温度、pH和金属离子的影响。该酰胺酶在60℃，pH6.0的缓冲体系中处理底物浓度为1μg/ml OTA毒素，3min内降解效率高达100％，Amh1对温度和酸性pH具有较强的适应性。菌株IFST‑OT3及由其产生的脱毒酶可用于农产品中赭曲霉毒素的降解，应用前景广阔。

技术研发人员：邢福国,王刚,吴文庆,郭旭
受保护的技术使用者：中国农业科学院农产品加工研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13