一种检测体液中miR-155含量的方法与流程

本发明涉及生物，具体涉及一种检测体液中mir-155含量的方法。

背景技术：

1、micrornas是一种内源性、非编码、单链小rna分子，长度约为20-24个核苷酸，在各种生物过程中调节关键功能，如早期发育、细胞增殖、凋亡和细胞死亡。一些人类疾病与其异常表达密切相关。例如，microrna-155(mir-155)是一种典型的多功能microrna，参与许多生物过程，如基因(mrna)的表达、细胞表型的发展和正常的细胞分化。因此，人们投入了大量的精力来构建一系列的扩增策略，以敏感和特异性地分析真实样本中低水平表达的核酸生物标记物。现阶段，研究人员开发出的主要扩增方法有sda、cha、hcr、rca和hrca等。但是单独的扩增手段仍不足以满足实际样本中mirnas低丰度的表达。因此，发展一种组合型的扩增方法是迫切需要的。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明的实施例提出了一种检测体液中mir-155含量的方法，其包括以下步骤：

2、(1)将待测样品加入到装有sambs/bio-h1复合物的试管中，再加入h2发夹dna，孵育60min后，用磁力架将产物sambs/bio-h1/h2分离出；

3、(2)将h3发夹dna、h4发夹dna和ru(phen)32+加入到装有sambs/bio-h1/h2的试管中，孵育120min后，用磁力架将产物sambs/dsdna/ru分离出；

4、(3)将产物sambs/dsdna/ru与1×pbs缓冲液和tpa混合，由bpcl发光分析仪和电化学工作站检测，获得ecl信号，将获得的ecl信号代入相关线性方程中，计算出待测样品中的mir-155浓度。

5、根据本发明实施例的一种检测体液中mir-155含量的方法，该方法借助cha-hcr双重信号扩增策略，并整合了磁分离富集的优势，构建了一个用于检测mir-155的均相电化学发光体系；mir-155可以通过碱基互补配对的方式特异性地打开bio-h1的茎端部分，形成sambs/bio-h1/mir-155双链构象并暴露bio-h1的粘性末端；随着发夹dna h2的引入，bio-h1的粘性末端可以竞争性地打开h2的茎端部分，同时使mir-155释放出来；而游离的mir-155会继续打开其他bio-h1的茎端部分，周而复始，从而产生第一次输入信号的循环放大效应；随后，h2发夹dna的粘性末端又能使h3和h4发夹dna像拉链一样不断聚集延申，从而产生相当长的双链体dna，完成输入信号的第二次循环放大效应。ru(phen)32+便得以嵌入其双链dna的氢键当中，完成最终信号的输出；通过对终产物测定电化学放光，以实现对mir-155浓度的检测。也就是说，当mir-155存在时，mir-155可以在均相溶液中触发催化发夹组装和链式杂交反应，发光物质ru(phen)32+嵌入到链式杂交反应产生的双链dna当中，利用磁分离富集的方法保证产物的纯度和较低的背景信号；由于催化发夹组装和链式杂交反应形成双链dna的量的变化，ru(phen)32+嵌入双链dna的量也产生相应的变化，再通过仪器探测ru(phen)32+发出的相应波长的光，从而实现了对mir-155浓度的检测。

6、由此，相较于相关技术中mir-155的检测方法，上述的方法基于cha-hcr双重核酸信号扩增的反应不断放大输入信号，通过ru(phen)32+嵌入双链dna中输出信号；通过整合磁分离富集技术可以轻松实现终产物的纯化和降低背景信号；能够在均相电化学发光领域中用于检测mir-155，从1fm到10nm的浓度范围内呈现较好的线性响应。

7、可选地，步骤(1)中，将sambs溶解在含牛血清白蛋白的1×pbs缓冲液中，加入bio-h1，轻轻摇晃孵育30min，使链霉亲和素与生物素发生特异性结合，随后用1×b2缓冲液洗涤，洗去多余的bio-h1，得到sambs/bio-h1复合物。

8、进一步地，步骤(1)中，sambs浓度为1mg/ml，用量为20μl；bio-h1浓度为10μm，用量为10μl；1×pbs缓冲液用量为90μl；牛血清白蛋白质量分数为0.1％；sambs和h1孵育时间为30min，孵育转速200rpm，孵育温度为37℃。

9、可选地，步骤(2)中，孵育转速200rpm，孵育温度为37℃。

10、可选地，步骤(3)中，1×pbs缓冲液用量为100μl；tpa浓度为20mm，用量为4μl；电压范围为0.4至1.6v，扫描速率为100mv/s，光电倍增管的电压为-900v。

11、可选地，步骤(3)中，线性方程为△ecl＝312.08lgcmir-155+1446.74。

12、本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

技术特征：

1.一种检测体液中mir-155含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，将sambs溶解在含牛血清白蛋白的1×pbs缓冲液中，加入bio-h1，轻轻摇晃孵育30min，使链霉亲和素与生物素发生特异性结合，随后用1×b2缓冲液洗涤，洗去多余的bio-h1，得到sambs/bio-h1复合物。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，sambs浓度为1mg/ml，用量为20μl；bio-h1浓度为10μm，用量为10μl；1×pbs缓冲液用量为90μl；牛血清白蛋白质量分数为0.1％；sambs和h1孵育时间为30min，孵育转速200rpm，孵育温度为37℃。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，孵育转速200rpm，孵育温度为37℃。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，1×pbs缓冲液用量为100μl；tpa浓度为20mm，用量为4μl；电压范围为0.4至1.6v，扫描速率为100mv/s，光电倍增管的电压为-900v。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，线性方程为△ecl＝312.08lgcmir-155+1446.74。

技术总结
本发明公开了一种检测体液中miR‑155含量的方法，该方法包括将待测样品加入到装有SAMBs/Bio‑H1复合物的试管中，再加入H2发夹DNA，孵育60min后，用磁力架将产物SAMBs/Bio‑H1/H2分离出；将H3发夹DNA、H4发夹DNA和Ru(phen)32+加入到装有SAMBs/bio‑H1/H2的试管中，孵育120min后，用磁力架将产物SAMBs/dsDNA/Ru分离出；将产物SAMBs/dsDNA/Ru与1×PBS缓冲液和TPA混合，由BPCL发光分析仪和电化学工作站检测，获得ECL信号，将获得的ECL信号代入相关线性方程中，计算出待测样品中的miR‑155浓度。该方法操作简单、信号稳定而且灵敏度高，有望在生命科学及医学临床检测等领域得到广泛应用。

技术研发人员：董诺,徐良震,蔡晓云,高茹心
受保护的技术使用者：厦门眼科中心有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13