利用CRISPR-Cas12a蛋白检测艰难梭菌的方法与流程

本发明涉及分子生物学检测，是一种利用crispr-cas12a蛋白检测艰难梭菌的方法。

背景技术：

1、艰难梭菌（ clostridium difficile）是一种严格厌氧的革兰氏阳性杆菌，是寄生在肠道内的正常菌群，但具有条件致病性。长期使用抗生素药物容易导致人肠道正常菌群失调，引发艰难梭菌生长占优势，艰难梭菌的过度繁殖会产生大量的肠毒素a、细胞毒素b素，导致抗菌药物相关性腹泻，严重者可引起伪膜性肠炎甚至死亡。因此，艰难梭菌的快速准确的鉴定，对于艰难梭菌感染的诊断以及及时准确的治疗具有重要意义。

2、目前临床上对于艰难梭菌感染的实验诊断主要采用检查病原体的微生物培养法和检测细菌毒素的免疫学方法。微生物培养法包括培养初筛、菌落形态观察、纯化培养、血清型鉴定和生化鉴定等，操作步骤复杂、繁琐，一般用时4天至7天，费时费力。不能满足临床腹泻快速诊断的要求。免疫学方法可直接检测标本中的艰难梭菌a 毒素和b毒素，特异性高，操作简单，但是敏感性低。分子诊断，诸如pcr方法在检测艰难梭菌上已经有较好的应用，大大缩短了检测的时间，但是这些方法需要使用复杂的仪器和装备精良的实验室。等温扩增方法，如lamp方法克服了pcr技术需要昂贵的设备仪器等缺点，具有操作简便，结果判断简单等优点。但lamp技术要求多对引物且对靶基因的要求较高，设计比较繁琐，限制了其进一步的应用。重组酶聚合酶扩增（rpa）是一种快速兴起的恒温扩增技术，在恒温（37℃）条件下即可获得可检测级别的扩增核酸。但在实际检测过程中，需要筛选出很多的引物才能达到较高的灵敏度。

3、是“clustered regularly interspaced short palindromic repeats”的缩写，指规律成簇的间隔短回文重复。cas是“crispr-associated”缩写，为crispr相关。crispr-cas系统是一个细菌及古细菌进化出来用以抵御噬菌体入侵的适应性机制，后被发现并发展成为一种由引导rna指引cas核酸酶对靶向基因进行特定核酸编辑的技术。目前，基于crispr的核酸快速检测技术主要分为两大类，即2020年诺贝尔化学奖得主jenniferdoudna开发的依赖于cas12a的称为detectr的核酸恒温检测技术，以及crispr专利所有者张锋开发的依赖于cas13a的称为sherlock的核酸恒温检测技术。其原理都是通过恒温扩增方法如rpa对目的片段进行扩增富集，扩增后的目的片段会被cas蛋白通过一段crrna的引导靶向识别，激活cas蛋白成为一个dna切割机（cas12a）或者rna切割机（cas13a），将附近所有的单链dna（cas12a）或者单链rna（cas13a）进行切割。这一特性作用于单链核酸荧光探针则可用于报告检测结果。

技术实现思路

1、本发明提供了一种利用crispr-cas12a蛋白检测艰难梭菌的方法，克服了上述现有技术之不足，其能在37℃下进行等温扩增，即可快速准确的实现对艰难梭菌特异基因的扩增和检测，无需像pcr一样通过变温仪器来实现扩增检测。

2、本发明的技术方案是通过以下措施来实现的：一种利用crispr-cas12a蛋白检测艰难梭菌的方法，按照下述步骤进行：步骤一，制备cas12a蛋白；步骤二，设计并合成适合rpa扩增的引物；步骤三，设计并合成适合cas12a蛋白的crrna；步骤四，设计并合成dna报告分子；步骤五，设计并合成阳性质粒；步骤六，制备阳性质粒；步骤七，配制扩增检测体系；步骤八，crispr-cas12a蛋白检测。

3、下面是对上述发明技术方案的进一步优化或/和改进：

4、上述cas12a蛋白为lbcas12a蛋白。

5、上述步骤二中，设计并合成适合rpa扩增的引物的具体过程为：根据保守的艰难梭菌tcdb基因，设计特异检测艰难梭菌的上游引物和下游引物，将设计好的所述上游引物和所述下游引物在ncbi中进行blast，显示是特异的艰难梭菌序列，其中，上游引物的核苷酸序列如seq id no.1所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.2所示，艰难梭菌tcdb基因的序列如seq id no.4所示。

6、上述步骤三中，设计并合成适合cas12a蛋白的crrna的具体过程为：根据cas12a蛋白的特点，在扩增的基因片段序列直接设计特异识别艰难梭菌的crrna，在ncbi中进行blast，显示是特异的tcdb基因序列，其中，crrna的核酸序列如seq id no.3所示。

7、上述步骤四中，dna报告分子的序列为荧光报告基团-ttatt-荧光淬灭基团，其中，荧光报告基团为fam、hex、tet、joe和vic中的一种，荧光淬灭基团为bhq1、bhq2和bhq中的一种。

8、上述步骤五中，设计并合成阳性质粒的具体过程为：将艰难梭菌tcdb基因的核酸序列克隆到puc57质粒中，克隆位点为sami，抗性为氨苄抗性，克隆菌株为dh5α。

9、上述步骤六中，制备阳性质粒的具体过程为：以1%接种量，接种到含有100μg/ml氨苄的lb培养基中，在摇床中37℃，220rpm过夜培养，吸取菌液，采用天根质粒提取试剂盒提取质粒，使用nanodrop2000测浓度，计算拷贝数，进行系列梯度稀释，以备后续使用。

10、上述步骤七中，扩增检测体系为50μl反应体系，扩增检测体系中的组分与用量包括：

11、rpa缓冲液            29.5μl；

12、上游引物 10μm        2.1μl；

13、下游引物 10μm        2.1μl；

14、核酸模板+双蒸水      13.8μl；

15、醋酸镁 280mm         2.5μl。

16、上述步骤八中，crispr-cas12a蛋白检测时，检测体系中的组分与用量包括：nebufferr2.1 10×            2μl；

17、cas12a蛋白 10mg/ml   0.5μl；

18、dna报告分子 10μm     1μl；

19、crrna 5μm            0.4μl；

20、检测产物+双蒸水      16.1μl。

21、上述crispr-cas12a蛋白检测的具体过程为：将nebufferr2.1、cas12a蛋白、dna报告分子、crrna、检测产物+双蒸水混合均匀后，通过荧光检测仪测试反应并观察结果，其中，荧光检测仪的温度设置为37℃。

22、本发明在等温条件下（37℃）进行，10分钟至60分钟内，即可实现对艰难梭菌特异基因的扩增和检测检测，检测灵敏度可以达到1.0×101copies/反应，该方法灵敏度高、特异性好，适用于艰难梭菌的快速检测。

技术特征：

1.一种利用crispr-cas12a蛋白检测艰难梭菌的方法，其特征在于按照下述步骤进行：步骤一，制备cas12a蛋白；步骤二，设计并合成适合rpa扩增的引物；步骤三，设计并合成适合cas12a蛋白的crrna；步骤四，设计并合成dna报告分子；步骤五，设计并合成阳性质粒；步骤六，制备阳性质粒；步骤七，配制扩增检测体系；步骤八，crispr-cas12a蛋白检测。

2.根据权利要求1所述的利用crispr-cas12a蛋白检测艰难梭菌的方法，其特征在于cas12a蛋白为lbcas12a蛋白。

3.根据权利要求1或2所述的利用crispr-cas12a蛋白检测艰难梭菌的方法，其特征在于步骤二中，设计并合成适合rpa扩增的引物的具体过程为：根据保守的艰难梭菌tcdb基因，设计特异检测艰难梭菌的上游引物和下游引物，将设计好的所述上游引物和所述下游引物在ncbi中进行blast，显示是特异的艰难梭菌序列，其中，上游引物的核苷酸序列如seqid no.1所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.2所示，艰难梭菌tcdb基因的序列如seqid no.4所示。

4.根据权利要求1或2或3所述的利用crispr-cas12a蛋白检测艰难梭菌的方法，其特征在于步骤三中，设计并合成适合cas12a蛋白的crrna的具体过程为：根据cas12a蛋白的特点，在扩增的基因片段序列直接设计特异识别艰难梭菌的crrna，在ncbi中进行blast，显示是特异的tcdb基因序列，其中，crrna的核酸序列如seq id no.3所示。

5.根据权利要求1至4任一项所述的利用crispr-cas12a蛋白检测艰难梭菌的方法，其特征在于步骤四中，dna报告分子的序列为荧光报告基团-ttatt-荧光淬灭基团，其中，荧光报告基团为fam、hex、tet、joe和vic中的一种，荧光淬灭基团为bhq1、bhq2和bhq中的一种。

6.根据权利要求1至5任一项所述的利用crispr-cas12a蛋白检测艰难梭菌的方法，其特征在于步骤五中，设计并合成阳性质粒的具体过程为：将艰难梭菌tcdb基因的核酸序列克隆到puc57质粒中，克隆位点为sami，抗性为氨苄抗性，克隆菌株为dh5α。

7.根据权利要求1至6任一项所述的利用crispr-cas12a蛋白检测艰难梭菌的方法，其特征在于步骤六中，制备阳性质粒的具体过程为：以1%接种量，接种到含有100μg/ml氨苄的lb培养基中，在摇床中37℃，220rpm过夜培养，吸取菌液，采用天根质粒提取试剂盒提取质粒，使用nanodrop2000测浓度，计算拷贝数，进行系列梯度稀释，以备后续使用。

8.根据权利要求1至7任一项所述的利用crispr-cas12a蛋白检测艰难梭菌的方法，其特征在于步骤七中，扩增检测体系为50μl反应体系，扩增检测体系中的组分与用量包括：

9.根据权利要求1至8任一项所述的利用crispr-cas12a蛋白检测艰难梭菌的方法，其特征在于步骤八中，crispr-cas12a蛋白检测时，检测体系中的组分与用量包括：

10.根据权利要求9所述的利用crispr-cas12a蛋白检测艰难梭菌的方法，其特征在于crispr-cas12a蛋白检测的具体过程为：将nebufferr2.1、cas12a蛋白、dna报告分子、crrna、检测产物+双蒸水混合均匀后，通过荧光检测仪测试反应并观察结果，其中，荧光检测仪的温度设置为37℃。

技术总结
本发明涉及分子生物学检测技术领域，是一种利用CRISPR‑Cas12a蛋白检测艰难梭菌的方法，其按照下述步骤进行：制备Cas12a蛋白；设计并合成适合RPA扩增的引物；设计并合成适合Cas12a蛋白的crRNA；设计并合成DNA报告分子；设计并合成阳性质粒；制备阳性质粒；配制扩增检测体系；CRISPR‑Cas12a蛋白检测。本发明在等温条件下（37℃）进行，10分钟至60分钟内，即可实现对艰难梭菌特异基因的扩增和检测检测，检测灵敏度可以达到1.0×10<supgt;1</supgt;Copies/反应，该方法灵敏度高、特异性好，适用于艰难梭菌的快速检测。

技术研发人员：郭荣,程秋婷,王江涛,张静,艾琳,刘万里,朱芸,李丽
受保护的技术使用者：新疆维吾尔自治区疾病预防控制中心
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13