一种PPFIBP1-RET融合基因及其检测试剂盒、检测方法和应用与流程

本发明属于基因检测，具体地，涉及一种ppfibp1-ret融合基因及其检测试剂盒、检测方法和应用。

背景技术：

1、ret基因位于10号染色体的长臂上，编码一个受体酪氨酸激酶。在正常的神经元、交感神经和副交感神经节、甲状腺c细胞、肾上腺髓细胞、泌尿生殖道细胞、睾丸生殖细胞都有表达。ret蛋白活化后会激活下游的信号通路(包含ras、mapk、erk、pi3k、akt等)，导致细胞增殖、迁移和分化。

2、染色体发生重排导致的ret基因融合也发生在非小细胞肺癌(nsclc)，ret基因融合在nsclc的频率约为1％-2％，目前四个ret基因的融合伴侣基因被鉴定出来，分别是kif5b、ccdc6、trim33和ncoa4。临床上还有更多的ret基因融合伴侣基因有待发掘，以提高nsclc的检测准确性。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，发明人在非小细胞肺癌临床样本研究中意外地发现了一种新型ret基因融合类型，即与ppfibp1基因融合，并开发基于荧光定量pcr技术检测ppfibp1-ret基因融合突变的方法，从而完成本发明。

2、本发明第一方面提供一种ppfibp1和ret融合基因，其氨基酸序列如seq id no.1所示。

3、该融合基因的断点发生在ppfibp1基因7号内含子上和ret基因11号内含子上。断点前序列如seq id no.2所示，属于ppfibp1基因；断点后序列如seq id no.3所示，属于ret基因。

4、ppfibp1基因编码的ppfibp1蛋白是lar蛋白-酪氨酸磷酸酶相互作用蛋白(liprin)家族的成员。liplin家族蛋白与跨膜蛋白酪氨酸磷酸酶lar家族的成员相互作用，对轴突引导和乳腺发育很重要。

5、ret基因是一个原癌基因，全名：proto-oncogene tyrosine-protein kinasereceptor ret，位于10号常染色体长臂(10q11.2)，全长60kb，包含21个外显子，编码1100个氨基酸的酪氨酸激酶受体超家族ret蛋白。ret基因在器官生成和神经发育中起到重要的作用。

6、上述融合基因发生在基因组层面，其转录本(即rna)的逆转录产物(即cdna)的核苷酸序列如seq id no.4所示。

7、本发明第二方面提供一种载体，其包含本发明第一方面所述的逆转录产物(cdna)序列。该载体可以用于制备阳性对照品。

8、本发明第三方面提供用于检测本发明第一方面所述融合基因表达的试剂盒，包括用于扩增所述融合基因的转录本的逆转录产物的第一引物对和靶向所述第一引物对的扩增产物的第一探针，所述第一引物对的上下游引物分别具有seq id no.5和seq idno.6所示核苷酸序列，所述第一探针具有seq id no.7所示核苷酸序列。

9、进一步地，所述试剂盒还包括用于扩增内参基因ref的第二引物对和靶向所述第二引物对的扩增产物的第二探针，其中，所述第二引物对的上下游引物分别具有seqidno.8和seq id no.9所示核苷酸序列，所述第二探针具有seq id no.10所示核苷酸序列，所述第二探针和所述第一探针利用不同荧光进行标记。

10、在本发明的一些实施方案中，所述第一探针，荧光基团连接在探针序列的5'端，选择fam基团，淬灭基团连接在探针的3'端，选择bhq1基团；所述第二探针，荧光基团连接在探针序列的5'端，选择rox基团，淬灭基团连接在探针的3'端，选择bhq2基团。

11、更进一步地，所述试剂盒还包括酶混合液，所述酶混合液包含逆转录酶和dna聚合酶。其中逆转录酶用于将待测样本的rna逆转录成cdna序列，dna聚合酶用于对cdna序列进行扩增。

12、本发明第四方面提供一种检测本发明第一方面所述融合基因表达的方法，包括以下步骤：

13、s1，获得待测样本的rna样本；

14、s2，利用本发明第五方面所述的试剂盒对所述核酸样本进行rt-qpcr扩增；

15、s3，分别得到融合基因和内参基因ref的扩增结果，若待测样本在融合基因扩增ct值＜40，且扩增曲线有明显的“s”型扩增曲线，则待测样本为ppfibp1-ret融合基因突变阳性。

16、在发明的一些实施方案中，进行扩增rt-qpcr扩增的体系如下：

17、20μl体系：第一引物对各引物0.8μl，第一探针0.4μl，第二引物对各引物0.4μl，第二探针0.3μl，无核酸酶水0.86μl，buffer 10μl，混合酶液1.04μl，待测样本的核酸样本5μl，

18、所述酶混合液包含2400u逆转录酶和24～30u dna聚合酶。

19、扩增程序如下：

20、52℃5分钟；95℃1分钟；95℃10秒，60℃30秒，收集荧光信号，45个循环。

21、本发明第五方面提供本发明第一方面所述的融合基因的表达检测试剂在制备用于预测或诊断肺癌的试剂盒中的应用。

22、在本发明的一些实施方案中，所述融合基因的表达检测试剂包括用于扩增所述融合基因的转录本的逆转录产物的第一引物对和靶向所述第一引物对的扩增产物的第一探针，所述第一引物对的上下游引物分别具有seq id no.5和seq id no.6所示核苷酸序列，所述第一探针具有seq id no.7所示核苷酸序列。

23、进一步地，所述表达检测试剂还包括用于扩增内参基因ref的第二引物对和靶向所述第二引物对的扩增产物的第二探针，其中，所述第二引物对的上下游引物分别具有seqid no.8和seq id no.9所示核苷酸序列，所述第二探针具有seq id no.10所示核苷酸序列，所述第二探针和所述第一探针利用不同荧光进行标记。

24、在本发明的一些实施方案中，所述第一探针，荧光基团连接在探针序列的5'端，选择fam基团，淬灭基团连接在探针的3'端，选择bhq1基团；所述第二探针，荧光基团连接在探针序列的5'端，选择rox基团，淬灭基团连接在探针的3'端，选择bhq2基团。

25、本发明的有益效果

26、相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

27、本发明提供了一种新型的融合基因，为癌症尤其是肺癌的筛查或诊断提供了更多的指标。

28、本发明基于荧光定量pcr技术检测所述融合基因，特异性强、灵敏度高、简便快捷、操作简单安全、自动化程度高。

技术特征：

1.一种ppfibp1和ret融合基因，其特征在于，其核苷酸序列如seq id no.1所示。

2.根据权利要求1所述的融合基因，其特征在于，其转录本的逆转录产物的核苷酸序列如seq id no.4所示。

3.一种载体，其特征在于，其包含权利要求2所述的逆转录产物序列。

4.用于检测权利要求1所述融合基因表达的试剂盒，其特征在于，包括用于扩增所述融合基因的转录本的逆转录产物的第一引物对和靶向所述第一引物对的扩增产物的第一探针，所述第一引物对的上下游引物分别具有seq id no.5和seq id no.6所示核苷酸序列，所述第一探针具有seq id no.7所示核苷酸序列。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括用于扩增内参基因ref的第二引物对和靶向所述第二引物对的扩增产物的第二探针，其中，所述第二引物对的上下游引物分别具有seq id no.8和seq id no.9所示核苷酸序列，所述第二探针具有seq id no.10所示核苷酸序列，所述第二探针和所述第一探针利用不同荧光进行标记。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括酶混合液，所述酶混合液包括逆转录酶和dna聚合酶。

7.根据权利要求4～6任一所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照品和/或阴性对照品。

8.一种检测权利要求1所述融合基因表达的方法，其特征在于，包括以下步骤：

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤2中，进行扩增rt-qpcr扩增的体系如下：

10.权利要求1所述的融合基因的表达检测试剂在制备用于预测或诊断肺癌的试剂盒中的应用。

技术总结
本发明公开了一种PPFIBP1和RET融合基因，属于基因检测技术领域。其中，所述融合基因核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明还公开了检测融合基因表达的试剂盒和方法及其应用。本发明提供了一种新型的融合基因，为癌症尤其是肺癌的筛查或诊断提供了更多的指标。本发明基于荧光定量PCR技术检测所述融合基因表达，特异性强、灵敏度高、简便快捷、操作简单安全、自动化程度高。

技术研发人员：田玉琦,蔡鑫勇,杨欢欢,陈艳莉
受保护的技术使用者：杭州联川生物技术股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13