多肽探针功能化的固态纳米通道及其制备方法和应用

本发明涉及蛋白质大分子检测，具体涉及一种多肽探针功能化的固态纳米通道及其制备方法和应用。

背景技术：

1、大多数现有功能化的固态纳米通道是基于在固态纳米通道的内壁上修饰的探针分子，这意味着靶标生物物质必须进入固态纳米通道内部才能与探针分子的相互作用。当涉及基质金属蛋白酶2等蛋白质生物大分子时，由于固态纳米通道内的受限空间，具有相对大尺寸的蛋白质生物大分子难以达到探针识别的位置，或者难以同时实现与大量探针的识别，从而导致检测效率低。若单纯调节固态纳米通道的孔径变大，会使得检测结果的重现性较差。

技术实现思路

1、基于此，有必要提供一种多肽探针功能化的固态纳米通道及其制备方法和应用，适用于基质金属蛋白酶2(mmp-2)的检测，特异性好。

2、本发明采用如下技术方案：

3、本发明提供一种能够与基质金属蛋白酶2特异性结合的多肽探针，其氨基酸序列包括：crrrrplglagffff。

4、本发明还提供一种多肽探针功能化的固态纳米通道，包含：固态纳米通道本体；位于所述固态纳米通道本体一侧的外膜金属修饰层；以及多肽探针，位于所述外膜金属修饰层同侧且接枝修饰所述固态纳米通道本体上，所述多肽探针为上述能够与基质金属蛋白酶2特异性结合的多肽探针。

5、在其中一些实施例中，所述固态纳米通道本体为表面具有羟基的阳极氧化铝。

6、在其中一些实施例中，所述外膜金属修饰层包含金层。

7、本发明还提供上述多肽探针功能化的固态纳米通道的制备方法，包括如下步骤：提供固态纳米通道本体；在所述固态纳米通道本体一侧表面形成外膜金属修饰层；采用还原剂将多肽探针还原得到含巯基的多肽；再将含巯基的多肽与固态纳米通道外膜金属修饰层反应，即得。

8、在其中一些实施例中，通过物理气相沉积法形成所述外膜金属修饰层。

9、在其中一些实施例中，所述还原剂选自三(2-羧乙基)膦。优选地，三(2-羧乙基)膦(tcep)还原剂与多肽的反应摩尔比例为100：1。

10、在其中一些实施例中，5nm多肽探针溶液与固态纳米通道外表面的反应比例为500μl:(0.2～0.3)cm2。

11、本发明还提供多肽探针功能化的固态纳米通道或者上述制备方法制备获得的多肽探针功能化的固态纳米通道在检测基质金属蛋白酶2中的应用。

12、在其中一些实施例中，基质金属蛋白酶2(mmp-2)的浓度可以分别为1ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml和150ng/ml。基质金属蛋白酶2(mmp-2)与多肽探针功能化的固态纳米通道外膜表面的比例为500μl:(0.2～0.3)cm2。

13、在其中一些实施例中，所述基质金属蛋白酶2可以来自hela癌细胞不同周期分泌的基质金属蛋白酶2。

14、优选地，通过不加血清的dmem培养基、含l-含羞草碱的培养基、含胸苷的培养基、含诺考达唑的培养基分别将hela癌细胞诱导至g0/g1、g1/s、s、g2/m四个周期。

15、其中一些实施例中，培养的hela癌细胞的密度分别为4×101cells/ml、4×103cells/ml、4×104cells/ml、4×105cells/ml、1×106cells/ml。然后收集不同培养细胞密度的培养基，并在400g的离心力下离心5分钟，除去漂浮细胞和碎片。接着收集得到的不同培养密度的hela癌细胞的培养与多肽探针功能化的固态纳米通道外膜的比例为500μl:(0.2～0.3)cm2。

16、本发明还提供一种检测基质金属蛋白酶2的方法，包括如下步骤：将含有基质金属蛋白酶2的溶液与多肽探针功能化的固态纳米通道反应，检测多肽探针功能化固态纳米通道反应前后的离子电流的变化。

17、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

18、本发明开发多肽探针功能化的固态纳米通道可以特异性结合基质金属蛋白酶2，含基质金属蛋白酶2的溶液、hela癌细胞的含基质金属蛋白酶2培养基、hela癌细胞不同细胞周期的含基质金属蛋白酶2的培养基样品均可以与多肽探针功能化的固态纳米通道反应，改变多肽探针功能化的固态纳米通道系统的跨膜离子电流，从而实现对基质金属蛋白酶2的检测。

技术特征：

1.一种能够与基质金属蛋白酶2特异性响应的多肽探针，其特征在于，其氨基酸序列包括：crrrrplglagffff。

2.一种多肽探针功能化的固态纳米通道，其特征在于，包含：

3.根据权利要求2所述多肽探针功能化的固态纳米通道，其特征在于，所述固态纳米通道本体为表面具有羟基的阳极氧化铝纳米通道。

4.根据权利要求2或3所述的多肽探针功能化的固态纳米通道，其特征在于，所述外膜金属修饰层包含金层。

5.如权利要求2至4任一项所述多肽探针功能化的固态纳米通道的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

6.根据权利要求5所述多肽探针功能化的固态纳米通道的制备方法，其特征在于，通过物理气相沉积法形成所述外膜金属修饰层。

7.根据权利要求5所述多肽探针功能化的固态纳米通道的制备方法，其特征在于，所述还原剂选自三(2-羧乙基)膦。

8.权利要求2至4任一项所述多肽探针功能化的固态纳米通道或者权利要求5至7任一项所述的制备方法制备获得的多肽探针功能化的固态纳米通道在检测基质金属蛋白酶2中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述基质金属蛋白酶2来自hela癌细胞不同周期分泌的基质金属蛋白酶2。

10.一种检测基质金属蛋白酶2的方法，其特征在于，包括如下步骤：

技术总结
本发明提供多肽探针功能化的固态纳米通道及其制备方法和应用。本发明中多肽探针功能化的固态纳米通道是在常规固态纳米通道外表面构建金属修饰层，然后通过金硫键将多肽探针修饰在含金属修饰层的金层的固态纳米通道外表面上。利用多肽探针功能化的固态纳米通道检测基质金属蛋白酶2(MMP‑2)，不仅可以实现对溶液中的MMP‑2的检测，还可以实现对HeLa癌细胞分泌的MMP‑2和HeLa癌细胞不同细胞周期分泌的MMP‑2的特异性检测。

技术研发人员：夏帆,娄筱叮,胡晶晶,蒋文莲
受保护的技术使用者：中国地质大学（武汉）
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13