用于构建人源FUS基因敲入的ALS果蝇模型的gRNA组合及其应用的制作方法

本申请涉及生物医学领域，更具体地，涉及一种用于构建人源fus基因敲入的als果蝇模型的grna组合及其应用。

背景技术：

1、肌萎缩侧索硬化症(als)是一种运动神经元退行性疾病，由遗传和环境等多因素引发，其中约5％的家族性als和1％的散发性als是由fus基因突变引起。fus蛋白是一种rna结合蛋白，参与rna代谢的多个方面，包括剪接、运输和翻译。传统的转基因模型常因致病基因的过量表达引起非生理人工表型，由此在药效验证和病理机制研究中的应用具有争议。因此，需要一种构建突变致病模型的方法，用于探索fus突变而不是过量表达在als发病机制中扮演的角色及als治疗方法。

技术实现思路

1、本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。

2、本发明的实施例提出了一种用于构建人源fus基因敲入的als果蝇模型的分离的核酸集及其应用。

3、一方面，本发明的实施方案提供了一种分离的核酸集，该核酸集为具有seq idno:1所示序列的核酸与具有seq id no:2至seq id no:4所示序列的核酸的至少一个的组合。

4、在一些实施方案中，所述核酸集为具有seq id no:1至seq id no:4所示序列的核酸的组合。

5、另一方面，本发明的实施方案提供了所述的分离的核酸集在构建构建人源fus基因敲入的als果蝇模型中的用途，包括将供体dna和grna组合引入表达cas9蛋白的果蝇受精卵中，从而在所述grna组合引导下通过所述cas9蛋白靶向敲除所述果蝇受精卵中的caz基因并通过同源重组获得所述供体dna敲入的工程化改造的果蝇受精卵，其中所述供体dna包含第一同源臂、所述人源fus基因和第二同源臂；所述grna组合为seq id no:1与seq idno:2至seq id no:4的至少一个的组合，seq id no:1指导所述cas9蛋白在所述caz基因的上游进行敲除；seq id no:2至seq id no:4的至少一个指导所述cas9蛋白在所述caz基因的下游进行敲除，优选地seq id no:2、seq id no:3和seq id no:4共同指导所述cas9蛋白在所述caz基因的下游进行敲除。

6、在一些实施方案中，供体dna和grna组合以4:1-1:1，优选4:1的质量比引入表达cas9蛋白的果蝇受精卵中。

7、在一些实施方案中，人源fus基因为野生型fus基因、fus-r521c突变体、fus-r524s突变体或fus-p525l突变体。

8、在一些实施方案中，供体dna构建在第一载体中，优选地第一载体还包含筛选标记和酶切位点，优选地第一载体为表达载体，该表达载体为慢病毒表达载体、腺病毒表达载体、腺相关病毒表达载体、piggybac表达载体或sleeping beauty转座载体。

9、在一些实施方案中，grna构建在第二载体中，优选地第二载体还包含启动子和终止子，优选地第二载体为pcfd5质粒，所述启动子是u6。

10、在一些实施方案中，第一载体从5'端至3'端依次包含1500bp的第一同源臂、3×flag-egfp标记、人源fus基因、dsred标记盒和1500bp的第二同源臂，优选地，第一载体在dsred标记盒两侧还包含loxp位点。

11、在一些实施方案中，构建人源fus基因敲入的als果蝇模型的方法还包括使工程化改造的受精卵发育为fus基因敲入的初代果蝇个体，并将fus基因敲入的初代果蝇个体与w1118果蝇杂交并与初代果蝇个体回交至少1代、优选6代，以获得fus基因敲入的纯合果蝇个体。

12、在一些实施方案中，人源fus基因敲入的als果蝇模型为各个发育阶段的果蝇和/或分离自果蝇的组织或细胞。

13、在一些实施方案中，人源fus基因敲入的als果蝇模型表现为寿命缩短、年龄依赖性运动和协调能力障碍和生殖能力下降。

14、在一些实施方案中，所述人源fus基因敲入的als果蝇模型或其品系用于筛选als相关疾病的药物。

15、利用本发明实施方案中提供的核酸集构建的人源fus基因敲入的als果蝇模型，具有以下有益效果：制备出的模型能够利用内源caz基因的启动子驱动导入的人源fus基因的内源性表达，从而使fus蛋白表达具有组织特异性且表达量维持在正常生理水平，解决了之前转基因模型中因过量表达而带来的剂量毒性效应。同时，与转基因动物中的全身组成型表达对比，更能反映病人体内的真实情况。给发病期较晚的神经退行性疾病，如als的发病机制研究和药物靶点筛选提供了更优越的选择。

技术特征：

1.一种分离的核酸集，其特征在于，所述核酸集为具有seq id no:1所示序列的核酸与具有seq id no:2至seq id no:4所示序列的核酸的至少一个的组合。

2.根据权利要求1所述的核酸集，其特征在于，所述核酸集为具有seq id no:1至seqid no:4所示序列的核酸的组合。

3.根据权利要求1所述的分离的核酸集在构建人源fus基因敲入的als果蝇模型中的用途，其特征在于，包括：

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，将所述供体dna和所述grna组合以4:1-1:1的质量比引入所述表达cas9蛋白的所述果蝇受精卵中。

5.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述人源fus基因为野生型fus基因、fus-r521c突变体、fus-r524s突变体或fus-p525l突变体。

6.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述供体dna构建在第一载体中，所述第一载体还包含筛选标记和酶切位点，所述第一载体为表达载体。

7.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述grna组合构建在第二载体中，所述第二载体还包含启动子和终止子。

8.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述第一载体从5'端至3'端依次包含1500bp的所述第一同源臂、3×flag-egfp标记、所述人源fus基因、dsred标记盒、1500bp的所述第二同源臂和位于所述dsred标记盒两侧的loxp位点。

9.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述人源fus基因敲入的als果蝇模型为各个发育阶段的果蝇和/或分离自果蝇的组织或细胞。

10.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述人源fus基因敲入的als果蝇模型或其品系用于筛选als相关疾病的药物。

技术总结
本发明涉及用于构建人源FUS基因敲入的ALS果蝇模型的gRNA组合及其应用。该gRNA组合的应用包括将供体DNA和合理设计的gRNA组合引入表达Cas9蛋白的果蝇受精卵中，从而在所述gRNA组合引导下通过所述Cas9蛋白靶向敲除所述果蝇受精卵中的caz基因并通过同源重组获得所述供体DNA敲入的工程化改造的果蝇受精卵。该模型能够使人源FUS蛋白表达具有和果蝇caz基因同样的组织特异性且表达量维持在正常生理水平，有利于反映病人体内的真实情况，为发病期较晚的神经退行性疾病的发病机制研究和药物靶点筛选提供了更优越的选择。

技术研发人员：贾怡昌
受保护的技术使用者：神济昌华（北京）生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12