本发明涉及环境修复，具体涉及一种tnt污染土壤的微生物降解菌剂及其制备方法和应用。
背景技术：
1、炸药化合物具有良好的稳定性，易与土壤结合，从而对土壤造成污染，受到污染的土壤经雨水冲刷、径流，随地下水迁移导致污染扩散。其中，2，4，6-三硝基甲苯(tnt)是军事和民用用途最广泛的炸药之一，由于其成本廉价、工艺成熟、使用安全等优点，在各行各业大量使用。此外，tnt的积累也会对人类和动物产生潜在的危险影响，包括上呼吸道问题、胃肠道疾病、贫血和再生障碍性贫血等。目前，tnt污染治理方法包括物理法、化学法和生物法。物化法虽然降解效果好，但是成本高且易引起二次污染，因此难以在实际生产中大规模推广应用。生物法由于费用低、无二次污染，成为了处理tnt污染的理想方法之一。
2、目前，利用微生物或其酶作为生物修复剂修复受污染的土壤和水被广泛研究。微生物降解tnt污染物主要依靠两种作用方式：其一，通过微生物分泌的胞外酶降解，；其二，污染物被微生物吸收至其细胞内后，由胞内酶降解。催化tnt生物降解的第一步为还原反应，分为硝基还原和芳环的直接加氧还原，随着还原反应的进行，tnt的还原产物可在其他酶的催化下被继续转化并以nh4+或no2-的形式释放出氮源。tnt的生物转化主要是通过硝基的还原而发生的，形成羟基胺和氨基二硝基甲苯的异构体。该反应在有氧条件下发生，由nsfa或pnra基因编码的氧不敏感硝基还原酶。参与tnt还原反应的酶种类有很多，主要包括硝基还原酶、老黄素酶和一些脱氧酶类。假单胞杆菌为需氧的革兰阴性小杆菌，假单胞菌属种类繁多，含有200余种，包括铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌、斯氏假单胞菌、门多萨假单胞菌、类产碱假单胞菌、产碱假单胞菌、维罗纳假单胞菌和蒙太利假单胞菌、摩西假单胞菌等。其中，目前报道的具有降解tnt能力的主要为铜绿假单胞菌和沼泽红假单胞菌。如申请号为cn201510563062.8的专利公开了一种铜绿假单胞菌、含有该菌的菌剂及其应用和降解tnt的方法，对于tnt污染土壤的降解，96d生物强化组降解率为93.6％，生物刺激+生物强化组降解率为98.1％。该方案降解时间过长，且需要额外的生物刺激。所以需要筛选出tnt高效降解菌并制备微生物菌剂用于tnt污染处理具有重要意义。
技术实现思路
1、针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种tnt污染土壤的微生物降解菌剂及其制备方法和应用。本发明利用恶臭假单胞菌t2、蕈状芽孢杆菌t3和解淀粉芽孢杆菌t10制备固体微生物复合菌粉，通过三菌种的协同作用，显著提高弹药销毁厂污染土壤tnt降解率。
2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
3、本发明的第一方面，提供一种tnt污染土壤的微生物降解菌剂，所述微生物降解菌剂包括：恶臭假单胞菌t2(pseudomonas putida)、蕈状芽孢杆菌t3(bacillus mycoides)、解淀粉芽孢杆菌t10(bacillus amyloliquefaciens)；
4、所述微生物降解菌剂中，恶臭假单胞菌t2的含量为(5-10)×108cfu/ml、蕈状芽孢杆菌t3的含量为(1-2.5)×109cfu/ml、解淀粉芽孢杆菌t10的含量为(4-8)×109cfu/ml。
5、优选的，所述恶臭假单胞菌t2的保藏号为cgmcc no.1.8829；所述蕈状芽孢杆菌t3的保藏号为cgmcc no.1.10168；所述解淀粉芽孢杆菌t10的保藏号为cgmcc no.1.8716。
6、本发明的第二方面，提供微生物降解菌剂的制备方法，包括以下步骤：
7、(1)分别将恶臭假单胞菌t2、蕈状芽孢杆菌t3和解淀粉芽孢杆菌t10接种于第一lb培养基中，发酵后得到恶臭假单胞菌t2种子菌液、蕈状芽孢杆菌t3种子菌液和解淀粉芽孢杆菌t10种子菌液；
8、(2)将恶臭假单胞菌t2种子菌液、蕈状芽孢杆菌t3种子菌液和解淀粉芽孢杆菌t10种子菌液按照4：4：2的体积比混合均匀得到混菌种子液，将混菌种子液接种于第二lb培养基中，发酵完成后将发酵物进行喷雾干燥，得到tnt污染土壤微生物降解粉状复合菌剂。
9、优选的，步骤(1)中，所述恶臭假单胞菌t2、蕈状芽孢杆菌t3和解淀粉芽孢杆菌t10的接种量均为1wt％。
10、优选的，步骤(1)中，所述第一lb培养基的组成为：胰蛋白胨10.0g/l，nacl 10.0g/l，酵母粉5.0g/l；所述第一lb培养基的ph为7.0。
11、优选的，步骤(1)中，所述发酵为150r/min，37℃发酵24小时。
12、优选的，步骤(2)中，所述混菌种子液的接种量为10wt％；所述第二lb培养基的组成为胰蛋白胨10.0～15.0g/l，酵母粉5.0～8.0g/l，nacl 10.0～15g/l；所述第二lb培养基的ph为7.0。
13、优选的，步骤(2)中，所述发酵为：20～37℃下，按照每分钟发酵液与通气量体积比1：1，通入无菌空气，150rpm通气搅拌发酵24～48h。
14、本发明的第三方面，提供微生物降解菌剂的在降解tnt污染土壤中的应用。
15、优选的，在弹药销毁场tnt污染土壤，按20～30wt％的添加量加入微生物降解菌剂并混合均匀，自然堆存10～30天，实现tnt污染土壤的降解。
16、本发明的有益效果：
17、(1)本发明利用恶臭假单胞菌t2、蕈状芽孢杆菌t3和解淀粉芽孢杆菌t10制备固体微生物复合菌粉，将没有降解tnt作用的三菌种复合，通过三菌种的协同作用，显著提高弹药销毁厂污染土壤tnt降解率。
18、(2)本发明制备的固体微生物复合菌粉进一步增强了对土壤中tnt的降解效果，并且本发明的制备方法简单、易于操作，复合菌粉成本低、对环境友好。
1.一种tnt污染土壤的微生物降解菌剂，其特征在于，所述微生物降解菌剂包括：
2.根据权利要求1所述的微生物降解菌剂，其特征在于，所述恶臭假单胞菌t2的保藏号为cgmcc no.1.8829；所述蕈状芽孢杆菌t3的保藏号为cgmcc no.1.10168；所述解淀粉芽孢杆菌t10的保藏号为cgmcc no.1.8716。
3.权利要求1或2所述的微生物降解菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述恶臭假单胞菌t2、蕈状芽孢杆菌t3和解淀粉芽孢杆菌t10的接种量均为1wt％。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述第一lb培养基的组成为：胰蛋白胨10.0g/l，nacl 10.0g/l，酵母粉5.0g/l；所述第一lb培养基的ph为7.0。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述发酵为150r/min，37℃发酵24小时。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述混菌种子液的接种量为10wt％；所述第二lb培养基的组成为胰蛋白胨10.0～15.0g/l,酵母粉5.0～8.0g/l，nacl10.0～15g/l；所述第二lb培养基的ph为7.0。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述发酵为：20～37℃下，通气搅拌发酵24～48h。
9.权利要求1或2所述的微生物降解菌剂的在降解tnt污染土壤中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，在弹药销毁场tnt污染土壤，按20～30wt％的添加量加入权利要求1或2所述的微生物降解菌剂并混合均匀，自然堆存10～30天，实现tnt污染土壤的降解。