氰胺诱导的酿酒酵母工程菌及其构建方法

本发明涉及生物工程，具体涉及一种氰胺诱导的酿酒酵母工程菌及其构建方法。

背景技术：

1、酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)是酵母种属中应用最广泛的菌株，也是最早实现工业化生产的微生物之一，其工业化应用历程反映了生物产业的发展。

2、在工业生产方面，酿酒酵母菌株具备良好的生产性能。相较于多数细菌菌株，酿酒酵母具备耐酸、不易受噬菌体等菌株污染的优点。酵母能够在低ph下进行发酵，这不仅减少用于控制ph的碱液消耗，而且能简化除盐工艺，有效降低了产品的分离成本。正是因为酿酒酵母强鲁棒性和集成分离工艺的经济性，在生产菌株性能差距不大的情况下，工业规模的生产会倾向于选择酿酒酵母菌株进行生产。

3、然而，想要最大化目标化合物的产量，就需要优化平衡酿酒酵母胞内代谢流、缓解细胞生产的代谢压力、解决降低中间产物积累等问题，以实现目标化合物高产量、高产率、高转化。要实现上述目的，调控合成途径酶的表达便是关键。

4、选用不同强度的启动子来调控外源基因的转录活性是一种常用的表达调控方法。在酿酒酵母中，有大量研究成熟的启动子可以使用，这些启动子主要分为组成型和诱导型两大类。组成型启动子使基因在所有组织中启动表达，不受外界条件的影响。这类启动子无需诱导物，所启动基因的表达具持续性。酿酒酵母中常用的组成型启动子有tef1、pgk等。然而组成型的持续表达使外源蛋白积累，可能导致代谢负担，造成菌体生长受阻等影响。

5、诱导型启动子在某些特定的物理或化学信号的刺激下，可以大幅度地提高基因的转录水平。诱导型启动子的转录活性受到诱导剂控制，进而能够实现时间、空间以及强度的调控。酿酒酵母中已发掘多种诱导型启动子，包括由铜离子诱导的cup1启动子、由半乳糖诱导的gal表达系统、被葡萄糖抑制及乙醇诱导的adh2启动子等。其中，gal1、gal10启动子因其调控机理清晰、表达严谨被广泛使用于外源基因的表达。gal1、gal10启动子受转录激活蛋白gal4及其抑制子gal80的调控，其以半乳糖为碳源启动表达。但是，半乳糖的价格昂贵，不利于工业化生产成本控制；此外，酵母的生长需要葡萄糖，转换碳源既会增加生产步骤，还会增加调控的复杂性，不利于规模化生产应用。

技术实现思路

1、本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的目的在于提供一种氰胺诱导的酿酒酵母工程菌及其构建方法。

2、为此，在本发明的一方面，本发明提出了一种氰胺诱导的酿酒酵母工程菌的构建方法，其包括：

3、将酿酒酵母菌中的gal80敲除，将酿酒酵母菌中的gal4启动子替换为氰胺诱导型ddi2/3启动子，在酿酒酵母菌内源的aro1基因的arod组分融合n端降解子，以便获得重组酿酒酵母菌。

4、根据本发明实施例的氰胺诱导的酿酒酵母工程菌的构建方法，该方法将酿酒酵母菌中的gal80基因敲除；将酿酒酵母菌中的gal4启动子替换为内源性ddi2/3氰胺诱导启动子，从而使酿酒酵母的半乳糖调控系统转变为氰胺诱导的严谨型酿酒酵母表达系统。当氰胺诱导系统进一步用于调控酿酒酵母菌中内源aro1突变体(n端降解子融合于arod组份)的活性时，氰胺诱导系统可严格控制烟草蚀刻病毒的半胱氨酸蛋白酶(tev)表达，在添加氰胺诱导时无法合成色氨酸和苯丙氨酸而致死，在不添加氰胺诱导时菌体保持正常生长。因此，本发明涉及的严谨可控且高效的酿酒酵母蛋白表达系统，未来可应用于高效表达蛋白，同时在酿酒酵母代谢工程领域具有研究和应用价值，具有巨大的工业化应用潜力。

5、另外，根据本发明上述实施例提出的氰胺诱导的酿酒酵母工程菌的构建方法，还可以具有如下附加的技术特征：

6、可选地，以酿酒酵母基因组为模板，以核苷酸序列如seq id no:1所示的gal80_del_f和核苷酸序列如seq id no:2所示的gal80_del_r为引物，经pcr扩增得到gal80敲除片段。

7、可选地，以酿酒酵母cen.pk2-1c基因组为模板，以核苷酸序列如seq id no:5所示的ddi2_intgal4_f和核苷酸序列如seq id no:6所示的ddi2_intgal4_r为引物，经pcr扩增得到ddi2/3启动子序列。

8、可选地，以核苷酸序列如seq id no:13所示的基因为模板，核苷酸序列如seq idno:9所示的ndegf-splitd_f和核苷酸序列为seq id no:10所示的ndegf-splitd_r为引物，经pcr扩增得到n端降解子核酸片段。

9、可选地，酿酒酵母菌中的gal80敲除，gal4启动子替换为ddi2/3启动子和n端降解子融合于酿酒酵母菌内源aro1基因的arod组分均是通过crispr/cas9无痕敲入技术操作。

10、在本发明的第二个方面，本发明提出由上述工程菌的构建方法构建得到的氰胺诱导的酿酒酵母工程菌。

11、根据本发明实施例的酿酒酵母工程菌，可实现利用廉价的氰胺作为诱导剂，实现酿酒酵母可控表达蛋白，并且具有较好的菌株稳定性。

12、本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

技术特征：

1.一种氰胺诱导的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，包括：

2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，以酿酒酵母基因组为模板，以核苷酸序列如seq id no:1所示的gal80_del_f和核苷酸序列如seq id no:2所示的gal80_del_r为引物，经pcr扩增得到gal80敲除片段。

3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，以酿酒酵母cen.pk2-1c基因组为模板，以核苷酸序列如seq id no:5所示的ddi2_intgal4_f和核苷酸序列如seq id no:6所示的ddi2_intgal4_r为引物，经pcr扩增得到ddi2/3启动子序列。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述n端降解子序列是以核苷酸序列如seq id no:13所示的n-degron为模板，以核苷酸序列如seq id no:09所示的ndegf-splitd_f和核苷酸序列如seq id no:10所示的ndegf-splitd_r为引物，经pcr扩增得到。

5.如权利要求1-4中任一项所述的构建方法，其特征在于，酿酒酵母菌中的gal80敲除，gal4启动子替换为ddi2/3启动子，n端降解子融合于酿酒酵母菌内源aro1基因的arod组分是通过crispr/cas9无痕敲入技术操作。

6.一种氰胺诱导的酿酒酵母工程菌，其特征在于，由如权利要求1-5中任一项所述的构建方法构建得到。

技术总结
本发明涉及一种氰胺诱导的酿酒酵母工程菌及其构建方法，其构建方法包括：将酿酒酵母菌中的半乳糖调控系统的转录抑制因子Gal80敲除，将酿酒酵母菌中的转录激活因子Gal4的启动子替换为氰胺诱导型DDI2/3启动子，所获的酿酒酵母工程菌可以使氰胺诱导系统偶联半乳糖(GAL)表达系统，实现氰胺剂量响应的GAL表达系统信号输出。当氰胺诱导系统用于调控酿酒酵母菌中内源ARO1突变体(N端降解子融合于AroD组份)的活性时，该表达系统表现出良好的低渗漏特征。因此，采用上述方法构建可得到严谨可控且高效的酿酒酵母蛋白表达系统，未来可应用于高效表达蛋白。

技术研发人员：袁吉锋,宋婧雅
受保护的技术使用者：厦门大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13