检测甲状腺癌分子分型相关基因突变的文库构建方法与流程

本发明涉及文库构建，具体为一种检测甲状腺癌分子分型相关基因突变的文库构建方法。

背景技术：

1、甲状腺癌(thyroid carcinoma)是最常见的内分泌系统恶性肿瘤，是头颈部最为常见的恶性肿瘤，约占全身恶性肿瘤的1％，包括乳头状癌(ptc)、滤泡状癌(ftc)、未分化癌(atc)和髓样癌(mtc)四种病理类型，其中dtc生物行为温和，预后较好，ptc最为常见。atc的恶性程度极高，中位生存时间仅7～10个月。mtc的预后居于两者之间。各种类型的甲状腺癌恶性程度不同，治疗方式和预后大相径庭。

2、研究发现，基因变异是甲状腺癌发生的基本驱动因素，甲状腺癌的发生常与mapk、pi3k/akt信号通路相关。mapk/erk信号通路的主要参与分子包括ras、raf、mek和erk等，pi3k/akt信号通路参与分子包括pten、pi3k、akt和mtor等，目前已经发现该通路中的多种激酶抑制剂能够抑制肿瘤细胞。因此，基于分子标记物的基因检测结果不仅可以辅助甲状腺癌分子分型，还能在甲状腺癌治疗和预后方面提供指导。

3、通过对甲状腺癌相关的28个基因突变和27个基因融合变异进行检测，可以用来辅助临床医生为甲状腺癌患者进行精准的分子分型，还可以指导患者靶向用药及预后评估，无疑具有非常重要的临床应用价值；鉴于此，我们提出了一种检测甲状腺癌分子分型相关基因突变的文库构建方法。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供了一种检测甲状腺癌分子分型相关基因突变的文库构建方法，解决了上述背景技术提到的问题。

2、为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种检测甲状腺癌分子分型相关基因突变的文库构建方法，所述文库构建方法包括以下步骤：

3、s1、从待测样本中提取dna，对提取的dna进行浓度和纯度检测；

4、s2、以步骤s1提取的dna为模板，用seq id no.1～37所示的核苷酸序列为引物，进行第一轮pcr扩增，纯化扩增产物；

5、s3、以步骤s2所述扩增产物为模板，使用建库试剂中的通用引物和接头，进行第二轮pcr扩增，纯化扩增产物，得到dna测序文库；

6、s4、从待测样本中提取纯化rna，对提取的rna进行浓度和纯度检测；

7、s5、以步骤s4提取的rna为模板，通过逆转录生成相应的cdna，纯化cdna；

8、s6、以步骤s5所述cdna为模板，用seq id no.38～64所示的核苷酸序列为引物，进行第一轮pcr扩增，纯化扩增产物；

9、s7、以步骤s6所述扩增产物为模板，使用建库试剂中的通用引物和接头，进行第二轮pcr扩增，纯化扩增产物，得到cdna测序文库；

10、s8、对步骤s3和步骤s7所述测序文库进行质检。

11、可选的，所述核苷酸序列seq id no.1～37所示的dna特异性引物混合池浓度为2μm。

12、可选的，所述核苷酸序列seq id no.38～64所示的rna特异性引物混合池浓度为6μm。

13、可选的，所述扩增产物纯化使用的磁珠为kapa pure磁珠。

14、一种检测甲状腺癌分子分型相关基因突变检测引物组合，所述引物组合包括dnapcr引物和rna pcr引物。

15、可选的，所述dna pcr引物包括akt1基因突变检测引物对、alk基因突变检测引物对、apc基因突变检测引物对、atm基因突变检测引物对、braf基因突变检测引物对、cdkn2a基因突变检测引物对、ctnnb1基因突变检测引物对、dicer1基因突变检测引物对、eif1ax基因突变检测引物对、ezh1基因突变检测引物对、gnas基因突变检测引物对、hras基因突变检测引物对、idh1基因突变检测引物对、kmt2c基因突变检测引物对、kras基因突变检测引物对、men1基因突变检测引物对、nras基因突变检测引物对、pik3ca基因突变检测引物对、pten基因突变检测引物对、ret基因突变检测引物对、spop基因突变检测引物对、stk11基因突变检测引物对、tert基因突变检测引物对、tp53基因突变检测引物对、tsc2基因突变检测引物对、tshr基因突变检测引物对、zfhx3基因突变检测引物对、znf148基因突变检测引物对。

16、可选的，所述rna pcr引物包括eml4-alk融合检测引物对、strn-alk融合检测引物对、tfg-alk融合检测引物对、ccdc6-ret融合检测引物对、ncoa4-ret融合检测引物对、prkar1a-ret融合检测引物对、trim33-ret融合检测引物对、erc1-ret融合检测引物对、ktn1-ret融合检测引物对、pcm1-ret融合检测引物对、golga5-ret融合检测引物对、trim24-ret融合检测引物对、hook3-ret融合检测引物对、fgfr3-baiap2l1融合检测引物对、fgfr3-tacc3融合检测引物对、fgfr2-bicc1融合检测引物对、fgfr2-casp7融合检测引物对、tpm3-ntrk1融合检测引物对、irf2bp2-ntrk1融合检测引物对、sqstm1-ntrk1融合检测引物对、tpr-ntrk1融合检测引物对、etv6-ntrk3融合检测引物对、eml4-ntrk3融合检测引物对、rbpms-ntrk3融合检测引物对、sqstm1-ntrk3融合检测引物对、akap9-braf融合检测引物对、pax8-pparγ融合检测引物对。

17、一种检测甲状腺癌分子分型相关基因突变的试剂盒，包括用于检测甲状腺癌分子分型相关基因突变的引物、逆转录试剂、建库试剂、阳性dna质控品、阳性rna融合质控品、阴性rna融合质控品、无核酸酶水。

18、可选的，所述逆转录试剂包括：有rna逆转录酶、5×缓冲液、0.1m dtt、dntps、rna酶抑制剂、随机引物。

19、可选的，所述建库试剂含有dna聚合酶、kcl、mgcl2、tris-hcl、dntps、通用引物、接头。

20、本发明提供了一种检测甲状腺癌分子分型相关基因突变的文库构建方法。具备以下有益效果：

21、(1)、该检测甲状腺癌分子分型相关基因突变的文库构建方法，可以同时检测27个融合变异，这些基因突变及融合变异都与甲状腺癌分子分型有关，因此其检测结果可以用来辅助临床医生为甲状腺癌患者进行分子分型，还可以指导患者靶向用药及预后评估。

22、(2)、该检测甲状腺癌分子分型相关基因突变的文库构建方法，引物组合、试剂盒及建库方法具有检测灵敏度高、特异性好、重复性好的特点。

技术特征：

1.一种检测甲状腺癌分子分型相关基因突变的文库构建方法，其特征在于：所述文库构建方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种检测甲状腺癌分子分型相关基因突变的文库构建方法，其特征在于：所述核苷酸序列seq id no.1～37所示的dna特异性引物混合池浓度为2μm。

3.根据权利要求1所述的一种检测甲状腺癌分子分型相关基因突变的文库构建方法，其特征在于：所述核苷酸序列seq id no.38～64所示的rna特异性引物混合池浓度为6μm。

4.根据权利要求1所述的一种检测甲状腺癌分子分型相关基因突变的文库构建方法，其特征在于：所述扩增产物纯化使用的磁珠为kapa pure磁珠。

5.一种用于如权利要求1-4所述文库构建方法的甲状腺癌分子分型相关基因突变检测引物组合，其特征在于：所述引物组合包括dna pcr引物和rna pcr引物。

6.根据权利要求5所述的一种检测甲状腺癌分子分型相关基因突变检测引物组合，其特征在于：所述dna pcr引物包括akt1基因突变检测引物对、alk基因突变检测引物对、apc基因突变检测引物对、atm基因突变检测引物对、braf基因突变检测引物对、cdkn2a基因突变检测引物对、ctnnb1基因突变检测引物对、dicer1基因突变检测引物对、eif1ax基因突变检测引物对、ezh1基因突变检测引物对、gnas基因突变检测引物对、hras基因突变检测引物对、idh1基因突变检测引物对、kmt2c基因突变检测引物对、kras基因突变检测引物对、men1基因突变检测引物对、nras基因突变检测引物对、pik3ca基因突变检测引物对、pten基因突变检测引物对、ret基因突变检测引物对、spop基因突变检测引物对、stk11基因突变检测引物对、tert基因突变检测引物对、tp53基因突变检测引物对、tsc2基因突变检测引物对、tshr基因突变检测引物对、zfhx3基因突变检测引物对、znf148基因突变检测引物对。

7.根据权利要求5所述的一种检测甲状腺癌分子分型相关基因突变检测引物组合，其特征在于：所述rna pcr引物包括eml4-alk融合检测引物对、strn-alk融合检测引物对、tfg-alk融合检测引物对、ccdc6-ret融合检测引物对、ncoa4-ret融合检测引物对、prkar1a-ret融合检测引物对、trim33-ret融合检测引物对、erc1-ret融合检测引物对、ktn1-ret融合检测引物对、pcm1-ret融合检测引物对、golga5-ret融合检测引物对、trim24-ret融合检测引物对、hook3-ret融合检测引物对、fgfr3-baiap2l1融合检测引物对、fgfr3-tacc3融合检测引物对、fgfr2-bicc1融合检测引物对、fgfr2-casp7融合检测引物对、tpm3-ntrk1融合检测引物对、irf2bp2-ntrk1融合检测引物对、sqstm1-ntrk1融合检测引物对、tpr-ntrk1融合检测引物对、etv6-ntrk3融合检测引物对、eml4-ntrk3融合检测引物对、rbpms-ntrk3融合检测引物对、sqstm1-ntrk3融合检测引物对、akap9-braf融合检测引物对、pax8-pparγ融合检测引物对。

8.一种用于如权利要求5-7所述的甲状腺癌分子分型相关基因突变的试剂盒，其特征在于：包括用于检测甲状腺癌分子分型相关基因突变的引物、逆转录试剂、建库试剂、阳性dna质控品、阳性rna融合质控品、阴性rna融合质控品、无核酸酶水。

9.根据权利要求8所述的一种检测甲状腺癌分子分型相关基因突变的试剂盒，其特征在于：所述逆转录试剂包括：有rna逆转录酶、5×缓冲液、0.1mdtt、dntps、rna酶抑制剂、随机引物。

10.根据权利要求8所述的一种检测甲状腺癌分子分型相关基因突变的试剂盒，其特征在于：所述建库试剂含有dna聚合酶、kcl、mgcl2、tris-hcl、dntps、通用引物、接头。

技术总结
本发明公开了一种检测甲状腺癌分子分型相关基因突变的文库构建方法，涉及文库构建技术领域。包括以下步骤：从待测样本中提取DNA、用SEQ ID NO.1～37所示的核苷酸序列为引物、使用建库试剂中的通用引物和接头、从待测样本中提取纯化RNA、通过逆转录生成相应的cDNA，纯化cDNA、用SEQ IDNO.38～64所示的核苷酸序列为引物、使用建库试剂中的通用引物和接头，进行第二轮PCR扩增以及对测序文库进行质检。该检测甲状腺癌分子分型相关基因突变的文库构建方法，可以同时检测27个融合变异，这些基因突变及融合变异都与甲状腺癌分子分型有关，因此其检测结果可以用来辅助临床医生为甲状腺癌患者进行分子分型，还可以指导患者靶向用药及预后评估。

技术研发人员：高琼
受保护的技术使用者：苏州璞瑞卓越生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15