一种大鼠骨髓间充质干细胞的分离及培养方法

本发明属于生物，尤其涉及一种大鼠骨髓间充质干细胞的分离及培养方法。

背景技术：

1、目前，现有的原代间充质干细胞来源有限，实验研究需大量使用3-5代培养细胞，现有的原代间充质干细胞提取及分离方法操作复杂，细胞产量和成活率低。本方明方法为间充质干细胞的研究和应用提供了丰富的材料来源，广泛存在于骨髓、脐带血、脂肪等组织的间充质干细胞(mesenchymalstemcells，mscs)，具有强大的增殖能力、多向分化潜能、免疫调节功能、来源方便、不存在免疫排斥、无伦理问题等特点，包括mscs的预处理和扩增、mscs的条件培养基(conditionedmedia，cm)、旁分泌因子、分泌蛋白质组、外泌体、细胞外囊泡(extracellularvesicles，evs)在内的mscs衍生物，具有更低的免疫原性、性质稳定、无成瘤及血栓风险等特点，采用mscs及其衍生物相关细胞疗法和无细胞疗法可能是治疗各种复杂疾病的最佳解决方案。mscs及其衍生物作为疾病创新疗法的成功很可能取决于更好地理解其的作用机制，以及确定在临床环境中使用它们的最佳策略，因此需要大量的原代间充质干细胞进行实验研究。

2、通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有的大鼠骨髓间充质干细胞体外分离及培养方法操作复杂，细胞产量和成活率低。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种大鼠骨髓间充质干细胞的分离及培养方法。

2、本发明是通过提取大鼠长骨骨髓中存在的间充质干细胞实现大量原代骨髓间充质干细胞的分离及培养，提供一种大鼠骨髓间充质干细胞的分离及培养方法，所述大鼠骨髓间充质干细胞的分离及培养方法包括：

3、步骤一，获取大鼠的离体的双侧股骨和胫骨，并剔除所述双侧股骨和胫骨表面的肌肉，并利用清洗液反复冲洗干净；(通过大鼠四肢长骨的获取，可显著提高原代间充质干细胞产量，剔除骨表面并清洗可排除肌肉、血管内皮、脂肪等细胞干扰原代细胞提取)

4、步骤二，在无菌条件下，剪除所述双侧股骨和胫骨的两头，并利用清洗液多次冲洗股骨胫骨两端断口；(剪除关节面后，骨髓腔暴露，清洗液反复冲洗造血细胞等进一步排除干扰，提高原代骨髓间充质干细胞纯度)

5、步骤三，将骨髓冲入培养液中，将细胞悬液直接接种于培养瓶中进行培养，待细胞80％汇合后胰蛋白酶消化传代培养；(细胞悬液接种至培养瓶中细胞生长速率较快，可快速扩增。)

6、步骤四，取健康生长第2代大鼠msc制成细胞悬液移至离心管中，离心；弃上清液，用清洗液调整细胞浓度；(调整细胞浓度至合适浓度，传代扩增产量及速率提高)

7、步骤五，加入兔抗鼠cd45、cd44、cd90单克隆抗体，室温孵育，得到大鼠骨髓间充质干细胞。(因大鼠骨髓间充质干细胞表征为cd44(－)，cd90(－)，cd45(+)，通过兔抗鼠cd45、cd44、cd90单克隆抗体可筛选骨髓间充质干细胞)

8、进一步，所述清洗液为pbs液。

9、进一步，所述步骤三中，培养液为：dmem培养液。

10、进一步，所述步骤三中，将细胞悬液直接接种于培养瓶中进行培养包括：24h后半换液。(半换液不仅可补充细胞生长营养物质，且保留间充质干细胞生长过程中分泌产生的外泌体、细胞外囊泡、microrna等物质，细胞生长环境适宜)

11、进一步，所述步骤三中，胰蛋白酶浓度为2.5g/l。

12、进一步，所述步骤四中，离心包括：1000r/min离心5min。(离心速率较常规800r/min提高，提高离心后细胞获得量)

13、进一步，所述步骤四中，调整细胞浓度包括：调整细胞浓度为1×106。

14、进一步，所述加入兔抗鼠cd45、cd44、cd90单克隆抗体包括：加入兔抗鼠cd45、cd44、cd90单克隆抗体各5μl。

15、进一步，所述步骤五中，室温孵育时间为15min。

16、进一步，所述室温孵育后还需进行：将孵育产物放入流式细胞仪中鉴定。

17、结合上述的技术方案和解决的技术问题，请从以下几方面分析本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：

18、第一、针对上述现有技术存在的技术问题以及解决该问题的难度，紧密结合本发明的所要保护的技术方案以及研发过程中结果和数据等，详细、深刻地分析本发明技术方案如何解决的技术问题，解决问题之后带来的一些具备创造性的技术效果。具体描述如下：

19、本发明提供了一种大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定方法，操作简单，细胞产量和成活率高。

20、第二，把技术方案看做一个整体或者从产品的角度，本发明所要保护的技术方案具备的技术效果和优点，具体描述如下：

21、本发明的大鼠骨髓间充质干细胞的分离及培养方法是一种较为理想的大鼠骨髓间充质干细胞培养方法，可以满足多种生理生化实验的要求。

22、第三，作为本发明的权利要求的创造性辅助证据，还体现在以下几个重要方面：本发明的技术方案转化后的预期收益和商业价值为：与现有分离培养方法相比，本发明所获得的大鼠骨髓mscs纯度高，活力较强；且本发明培养细胞所需时间短，原代细胞培养7-8天后细胞即可生长至快速扩增期；对分离的细胞无损伤。具有稳定数量、高质量扩增培养大鼠骨髓mscs需求，可高效满足多种生理生化实验的要求。

技术特征：

1.一种大鼠骨髓间充质干细胞的分离及培养方法，其特征在于，所述大鼠骨髓间充质干细胞的分离及培养方法包括：

2.如权利要求1所述大鼠骨髓间充质干细胞的分离及培养方法，其特征在于，所述清洗液为pbs液。

3.如权利要求1所述大鼠骨髓间充质干细胞的分离及培养方法，其特征在于，所述步骤三中，培养液为：dmem培养液。

4.如权利要求1所述大鼠骨髓间充质干细胞的分离及培养方法，其特征在于，所述步骤三中，将细胞悬液直接接种于培养瓶中进行培养包括：24h后半换液。

5.如权利要求1所述大鼠骨髓间充质干细胞的分离及培养方法，其特征在于，所述步骤三中，胰蛋白酶浓度为2.5g/l。

6.如权利要求1所述大鼠骨髓间充质干细胞的分离及培养方法，其特征在于，所述步骤四中，离心包括：1000r/min离心5min。

7.如权利要求1所述大鼠骨髓间充质干细胞的分离及培养方法，其特征在于，所述步骤四中，调整细胞浓度包括：调整细胞浓度为1×106。

8.如权利要求1所述大鼠骨髓间充质干细胞的分离及培养方法，其特征在于，所述加入兔抗鼠cd45、cd44、cd90单克隆抗体包括：加入兔抗鼠cd45、cd44、cd90单克隆抗体各5μl。

9.如权利要求1所述大鼠骨髓间充质干细胞的分离及培养方法，其特征在于，所述步骤五中，室温孵育时间为15min。

10.如权利要求1所述大鼠骨髓间充质干细胞的分离及培养方法，其特征在于，所述室温孵育后还需进行：将孵育产物放入流式细胞仪中鉴定。

技术总结
本发明属于生物技术领域，公开了一种大鼠骨髓间充质干细胞的分离及培养方法，包括：获取大鼠的双侧股骨和胫骨，剔除表面的肌肉，并利用清洗液反复冲洗干净；在无菌条件下，剪除所述双侧股骨和胫骨的两头，并利用清洗液多次冲洗股骨胫骨两端断口；将骨髓冲入培养液中，将细胞悬液直接接种于培养瓶中进行培养，待细胞80％汇合后胰蛋白酶消化传代培养；取健康生长第2代大鼠MSC制成细胞悬液移至离心管中，离心；弃上清液，用清洗液调整细胞浓度；加入兔抗鼠CD45、CD44、CD90单克隆抗体，室温孵育，得到大鼠骨髓间充质干细胞。本发明提供了一种大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定方法，操作简单，细胞产量和成活率高。

技术研发人员：朱峰,王玉松,马琪敏,刘晓彬,沈拓,侯文佳,王丹,房贺,范晓明,孙瑜,郑兴锋
受保护的技术使用者：中国人民解放军海军军医大学第一附属医院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/11