一种微流控芯片及体外三维类器官模型构建方法

本发明属于人体器官模拟，尤其涉及一种微流控芯片及体外三维类器官模型构建方法。

背景技术：

1、本部分的陈述仅仅是提供了与本发明相关的背景技术信息，不必然构成在先技术。

2、可靠的、接近人体真实情况的体外模型用来模拟器官组织及生理病理状态，是推动基础研究以及临床精准治疗药物研发的重要基础。目前生物医学研究主要依赖动物模型，但是动物模型存在的一定的局限性，如价格昂贵、伦理问题等。另外，某些药物在动物模型中已被充分证明是安全、有效的，但是在真正临床应用中仍有高达90％以上宣布失败，这主要由于动物模型无法完全模拟复杂的人体生理系统造成的。更重要的是，动物模型无法实时观察器官组织在分子水平上的实时动态变化，不利于疾病发生基本机制的深入研究。

3、近年来，体外类器官模型发展迅速，在疾病建模、药物筛选和精准医疗等领域均有应用。类器官技术主要包括基于基质胶的3d类器官技术、3d打印技术及器官芯片技术等。其中，基于基质胶的3d类器官技术主要通过诱导各种干细胞或祖细胞在基质胶中分化并进一步培养形成与目标组织类似的三维细胞复合体。但是该方法往往无法实现液体动态刺激，不能还原真实的生理环境，还会造成某些与流动刺激相关的分子标志物丢失。3d打印技术虽然能够实现器官的体外初步重建，但是该技术目前可用的材料有限，尤其缺少毒性低且适合细胞长期生长的材料。

4、目前器官芯片已实现了多种体外器官的构建，如中枢神经系统、心脏、肝脏、胰腺等。这些类器官模型虽然包含了特异性的细胞成分，但是有些方法是静态培养系统，忽略了血管及血液流动的模拟，而血管及血液流动是人体各个器官不可或缺的重要部分，它不仅能为器官输送营养物质，实现各个器官的物质交流，还能带走代谢废物及其他有害物质。因此，血液流动的模拟在体外器官模型构建中至关重要。另外，某些器官芯片模型缺少细胞的三维生长，这与真实的器官空间结构有较大差别。

技术实现思路

1、为了解决上述背景技术中存在的技术问题，本发明提供一种微流控芯片及体外三维类器官模型构建方法，其中，微流控芯片中可通过通入不同种类的细胞实现不同器官的模拟。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、本发明的第一个方面提供一种微流控芯片。

4、在一个或多个实施例中，一种微流控芯片，其由下层玻璃基片及上层pdms材质聚合物层键合而成；所述上层pdms材质聚合物层中设置有若干个相互平行的直通道，任意两个相邻的直通道之间由若干个分支通道进行连通；所述分支通道用于将不同直通道分隔开以及允许不同细胞分泌的各种细胞因子通过，实现不同细胞间的交流。

5、作为一种实施方式，所述上层pdms材质聚合物层中设置有四个相互平行的直通道；其中，中间两个平行直通道内的细胞共同组成血脑屏障结构；外侧两个直通道用于通入培养基平衡整个微流控系统。

6、作为一种实施方式，中间两个平行直通道中的一个用于培养血管内皮细胞的生长来模拟血管，另外一个相邻的直通道用于培养星形胶质细胞来模拟大脑。

7、作为一种实施方式，所述中间两个平行直通道的尺寸为1500μm×600μm×100μm，另外两个平行直通道的尺寸为1500μm×300μm×100μm。

8、作为一种实施方式，所述分支通道的尺寸为100μm×3μm×1μm。

9、本发明的第二个方面提供一种体外三维类器官模型构建方法。

10、在一个或多个实施例中，一种体外三维类器官模型构建方法，其包括：

11、预处理如上述所述的微流控芯片；

12、在血管通道内通入设定密度的内皮细胞，放入细胞培养箱正置设定时间使部分细胞在通道底部贴壁后，再将预处理后的微流控芯片倒置，使未贴壁的细胞在通道顶部贴壁；随后在培养箱中正置设定时间，使细胞完全贴壁生长；

13、获取细胞凝胶混合物并将其通入3d大脑通道中，然后将所述微流控芯片放入细胞培养箱中，凝胶完全聚合，使得星形胶质细胞均匀分布在三维凝胶支架上；

14、在血液通道中，将细胞培养基持续灌注，经设定时间流动刺激，内皮细胞形成紧密连接的内皮细胞层，得到完整的血脑屏障体外模型；

15、表征脑屏障体外模型的结构及功能。

16、作为一种实施方式，预处理微流控芯片的过程为：

17、在两个中间通道内通入设定浓度的纤维连接蛋白和iv型胶原混合物，将芯片放入细胞培养箱中静置过夜后，用pbs对通道冲洗三次除去过量的混合物。

18、作为一种实施方式，获取细胞凝胶混合物的过程为：

19、在冰浴条件下，将i型胶原蛋白加入到naoh溶液中，混匀后，加入pbs中并混匀，最后再加入星形胶质细胞，即得到细胞凝胶混合物。

20、作为一种实施方式，在表征脑屏障体外模型的结构及功能的过程中，利用共聚焦荧光成像技术对脑屏障体外模型中的细胞存活率、特异性蛋白表达及荧光小分子物质扩散率进行检测。

21、作为一种实施方式，细胞存活率利用活死细胞calcein-am/pi染色试剂盒检测；特异性蛋白表达利用免疫荧光染色技术检测；荧光小分子物质为fitc标记的葡聚糖，结合菲克第一扩散定律及通道内荧光强度变化，确定渗透率。

22、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

23、(1)本发明提供了一种微流控芯片，其由下层玻璃基片及上层pdms材质聚合物层键合而成，其中，上层pdms材质聚合物层中设置有若干个相互平行的直通道，任意两个相邻的直通道之间由若干个分支通道进行连通，这样能够在分支通道中通入不同种类的细胞实现不同器官的模拟；而且本发明的微流控芯片能够结合多种分析方法如荧光成像、icp-ms以及pcr测序等，为后续的研究提供有力的平台。

24、(2)本发明所构建的体外三维类器官模型一方面，操作简单、方便，能够快速建立与真实血脑屏障具有相似结构和功能的体外血脑屏障模型；另一方面，所建立的方法不局限于血脑屏障的模拟，更能通过自由变换接种的细胞类型实现任意器官的模拟，具有更广阔的应用范围。

25、本发明附加方面的优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

技术特征：

1.一种微流控芯片，其特征在于，由下层玻璃基片及上层pdms材质聚合物层键合而成；所述上层pdms材质聚合物层中设置有若干个相互平行的直通道，任意两个相邻的直通道之间由若干个分支通道进行连通；所述分支通道用于将不同直通道分隔开以及允许不同细胞分泌的各种细胞因子通过，实现不同细胞间的交流。

2.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述上层pdms材质聚合物层中设置有四个相互平行的直通道；其中，中间两个平行直通道内的细胞共同组成血脑屏障结构；外侧两个直通道用于通入培养基平衡整个微流控系统。

3.如权利要求2所述的微流控芯片，其特征在于，中间两个平行直通道中的一个用于培养血管内皮细胞的生长来模拟血管，另外一个相邻的直通道用于培养星形胶质细胞来模拟大脑。

4.如权利要求2所述的微流控芯片，其特征在于，所述中间两个平行直通道的尺寸为1500μm×600μm×100μm，另外两个平行直通道的尺寸为1500μm×300μm×100μm。

5.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述分支通道的尺寸为100μm×3μm×1μm。

6.一种体外三维类器官模型构建方法，其特征在于，包括：

7.如权利要求6所述的体外三维类器官模型构建方法，其特征在于，预处理微流控芯片的过程为：

8.如权利要求6所述的体外三维类器官模型构建方法，其特征在于，获取细胞凝胶混合物的过程为：

9.如权利要求6所述的体外三维类器官模型构建方法，其特征在于，在表征脑屏障体外模型的结构及功能的过程中，利用共聚焦荧光成像技术对脑屏障体外模型中的细胞存活率、特异性蛋白表达及荧光小分子物质扩散率进行检测。

10.如权利要求9所述的体外三维类器官模型构建方法，其特征在于，细胞存活率利用活死细胞calcein-am/pi染色试剂盒检测；特异性蛋白表达利用免疫荧光染色技术检测；荧光小分子物质为fitc标记的葡聚糖，结合菲克第一扩散定律及通道内荧光强度变化，确定渗透率。

技术总结
本发明属于人体器官模拟技术领域，提供了一种微流控芯片及体外三维类器官模型构建方法。其中，微流控芯片由下层玻璃基片及上层PDMS材质聚合物层键合而成；所述上层PDMS材质聚合物层中设置有若干个相互平行的直通道，任意两个相邻的直通道之间由若干个分支通道进行连通；所述分支通道用于将不同直通道分隔开以及允许不同细胞分泌的各种细胞因子通过，实现不同细胞间的交流。

技术研发人员：唐波,李璐,范媛媛
受保护的技术使用者：山东师范大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/11