一种以壳聚糖为辅助碳源来发酵黑曲霉并制备含壳寡糖的微生物菌剂及其制备方法与流程

本发明涉及微生物菌剂，具体涉及一种以壳聚糖为辅助碳源来发酵黑曲霉并制备含壳寡糖的微生物菌剂及其制备方法。

背景技术：

1、壳聚糖是一种碱性多糖，在c2位上被一个乙酰氨基和氨基所代替，使其含有游离氨基，具有生物降解性、细胞亲和性等性能；壳聚糖分子中的氨基基团活性大，使其具有优异的生物学功能，因此，对壳聚糖作为功性能生物材料的研究越来越多。

2、壳聚糖在自然界中大量存在，但是由于其溶解性差，使其难以利用，从而导致壳聚糖的浪费较大。壳聚糖分解后是一种良好的农用生物刺激素，在农业种植中具有良好的应用前景，然而，该分解过程需要在酸性、加酶条件下进行，而壳聚糖酶在市场售价高达每公斤5000-6000余元，导致壳聚糖酶解的成本高，不利于通过该种方式将其应用在农业领域。

3、壳聚糖作为与纤维素结构相似的物质，对其在发酵中的研究较少，如何将壳聚糖作为碳源在生物发酵中使用以提高其利用率、降低其酶解成本对行业来说具有重要意义。

技术实现思路

1、针对现有技术的上述不足，本发明提供了一种以壳聚糖为辅助碳源来发酵黑曲霉并制备含壳寡糖的微生物菌剂及其制备方法，该微生物菌剂中，黑曲霉的有效活菌数为2-20亿/ml，壳寡糖含量为1-1.6％；在微生物菌剂的制备过程中，采用流加壳聚糖的方式向发酵液中加入壳聚糖液体，利用黑曲霉的代谢产物将壳聚糖酶解成壳寡糖，并以壳寡糖为辅助碳源进行发酵，一方面降低壳聚糖酶解成本，另一方面降低培养过程中碳源的加入，降低发酵成本。本发明提供的微生物菌剂，能够对作物产生促生作用。

2、本发明的技术方案如下：

3、一种以壳聚糖为辅助碳源来发酵黑曲霉并制备含壳寡糖的微生物菌剂，该微生物菌剂中，黑曲霉的有效活菌数为2-20亿/ml，壳寡糖含量为1-1.6％。

4、上述以壳聚糖为辅助碳源来发酵黑曲霉并制备含壳寡糖的微生物菌剂的制备方法，过程如下：

5、(1)种子液：

6、在1l药瓶中装入200ml pda培养基，121℃灭菌20min，备用；

7、取实验室保存的黑曲霉平板，无菌条件下接种至摇瓶中，在30℃、180转/min条件下培养3-5天，镜检无杂菌即可；种子液中，黑曲霉的菌体量为7×108-9×108个孢子/ml；该黑曲霉的编号为cicc2215；

8、(2)发酵：

9、配置发酵培养基，以2-5％的接种量将种子液接种至发酵培养基中，30℃培养70-80小时，得发酵液，镜检；

10、(3)菌剂：

11、当镜检出现大量菌丝时，向发酵液中流加壳聚糖溶液，壳聚糖溶液中的壳聚糖重量与发酵液重量的比值为0.5-2∶100，在28-30℃条件下继续发酵120-155小时，离心，得到液体微生物菌剂。

12、优选的，在步骤(2)中，所述发酵培养基包括麸皮45-55g、葡萄糖22-30g、硫酸铵17-22g，k2hpo4 0.7-1.5g、kcl 0.2-0.6g，mgso4·7h2o 0.4-0.7g，na2so4 0.4-0.8g，feso4·7h2o 0.1-0.15g，加水定容至1l，ph自然。

13、优选的，所述发酵培养基为麸皮50g、葡萄糖30g、硫酸铵20g，k2hpo4 1g，kcl 0.5g，mgso4·7h2o 0.5g，na2so4 0.5g，feso4·7h2o 0.1g，加水定容至1l，ph自然。

14、优选的，在步骤(3)中，所述壳聚糖经脱乙酰基后使用。

15、优选的，在步骤(3)中，所述壳聚糖提前粉碎至100目以上，使其易于溶解于冰醋酸中。

16、优选的，在步骤(3)中，所述壳聚糖溶液，制备方法为：使用前2-3小时，将壳聚糖与冰醋酸混合，壳聚糖与冰醋酸的重量比为1：5，将壳聚糖溶解在冰醋酸中，然后向发酵液中流加。

17、优选的，在步骤(3)中，由于冰醋酸具有很大酸性，容易影响发酵过程，因此，控制流加时间，避免对发酵过程产生不利影响；流加时间在5-8小时之间。

18、优选的，在步骤(3)中，黑曲霉发酵液通过5000r/min的条件下离心10min，分别取上清液，即为微生物菌剂。

19、黑曲霉是常见的微生物，广泛分布于土壤、粮食、植物性产品中，在发酵过程中，能够产生多种酶、没食子酸等代谢产物，能够为作物生产提供营养元素，具有良好的应用前景；将黑曲霉的发酵过程与壳聚糖酶解过程相结合，利用黑曲霉代谢产物对壳聚糖酶解，有效降低壳聚糖酶解成本，且得到的微生物菌剂中不仅含有大量的代谢产物，而且含有酶解壳聚糖后的壳寡糖，使得该微生物菌剂应用于作物时，能够刺激作物生长，提高壳聚糖的利用率和使用率。

20、相对于现有技术，本发明的有益效果在于：

21、1、本发明将黑曲霉发酵与壳聚糖酶解同步进行，利用黑曲霉的代谢产物将壳聚糖酶解成壳寡糖，并以壳寡糖为辅助碳源进行发酵，一方面降低壳聚糖酶解成本，另一方面降低培养过程中碳源的加入，降低发酵成本。

22、2、本发明提供的微生物菌剂，能够刺激作物生长，对作物具有促生作用。

技术特征：

1.一种以壳聚糖为辅助碳源来发酵黑曲霉并制备含壳寡糖的微生物菌剂，其特征在于，该微生物菌剂中，黑曲霉的有效活菌数为2-20亿/ml，壳寡糖含量为1-1.6％。

2.如权利要求1所述的以壳聚糖为辅助碳源来发酵黑曲霉并制备含壳寡糖的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，过程如下：

3.如权利要求2所述的以壳聚糖为辅助碳源来发酵黑曲霉并制备含壳寡糖的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述发酵培养基包括麸皮45-55g、葡萄糖25-35g、硫酸铵17-22g，k2hpo4 0.7-1.5g、kcl 0.2-0.6g，mgso4·7h2o 0.4-0.7g，na2so4 0.4-0.8g，feso4·7h2o 0.1-0.15g，加水定容至1l，ph自然。

4.如权利要求3所述的以壳聚糖为辅助碳源来发酵黑曲霉并制备含壳寡糖的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基为麸皮50g、葡萄糖30g、硫酸铵20g，k2hpo4 1g，kcl 0.5g，mgso4·7h2o 0.5g，na2so4 0.5g，feso4·7h2o0.1g，加水定容至1l，ph自然。

5.如权利要求2所述的以壳聚糖为辅助碳源来发酵黑曲霉并制备含壳寡糖的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述壳聚糖经脱乙酰基后使用。

6.如权利要求2所述的以壳聚糖为辅助碳源来发酵黑曲霉并制备含壳寡糖的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述壳聚糖提前粉碎至100目以上，使其易于溶解于冰醋酸中。

7.如权利要求2所述的以壳聚糖为辅助碳源来发酵黑曲霉并制备含壳寡糖的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述壳聚糖溶液，制备方法为：使用前2-3小时，将壳聚糖与冰醋酸混合，壳聚糖与冰醋酸的重量比为0.5-3：100，将壳聚糖溶解在冰醋酸中，然后向发酵液中流加。

8.如权利要求2所述的以壳聚糖为辅助碳源来发酵黑曲霉并制备含壳寡糖的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，流加时间在5-8小时之间。

技术总结
本发明提供了一种以壳聚糖为辅助碳源来发酵黑曲霉并制备含壳寡糖的微生物菌剂及其制备方法，该微生物菌剂中，黑曲霉的有效活菌数为2‑20亿/ml，壳寡糖含量为1‑1.6％；在微生物菌剂的制备过程中，采用流加壳聚糖的方式向发酵液中加入壳聚糖液体，利用黑曲霉的代谢产物将壳聚糖酶解成壳寡糖，并以壳寡糖为辅助碳源进行发酵，一方面降低壳聚糖酶解成本，另一方面降低培养过程中碳源的加入，降低发酵成本。本发明提供的微生物菌剂，能够对作物产生促生作用。

技术研发人员：赵兰瑞,张俊庆,王春环,曹长旺,李宝健,徐振龙
受保护的技术使用者：山东植之道生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12