一种微量样品的全长环状RNA鉴定方法

一种微量样品的全长环状rna鉴定方法
技术领域
1.本发明涉及环状rna鉴定方法，特别涉及一种微量样品的全长环状rna鉴定方法。


背景技术：

2.环状rna是一类具有共价闭合环状结构的rna分子，它们参与了许多重要的生物过程。很多研究表明环状rna具有充当mirna海绵的功能，同时也具有增强蛋白功能、编码多肽、调节转录的作用。目前，通过二代测序技术进行rna测序，分析反式剪切位点来鉴定环状rna的方法已被普遍应用。然而，基于短读长的二代测序技术并不能获得环状rna的全长序列，这使得大量环状rna内部的可变剪切事件一直没被发现；同时也限制了对环状rna的特征及功能的研究，例如进行环状rna的可翻译性研究就需要了解完整的环状结构。随着测序技术的发展，长度长测序技术使得获得全长的环状rna序列成为可能。目前基于长度长测序技术进行全长环状rna鉴定的方法，对于样本的起始rna量要求较高，都需要至少微克级的rna，对于无法获得足够量的样本则不能进行有效的鉴定。但是，在许多情况下，获得至少微克级的样品量是十分困难的，特别是在实际应用当中，例如临床诊断样本的环状rna鉴定。因此，针对微量或者稀有样本的环状rna鉴定目前尚无有效方法，这无疑阻碍了环状rna的研究在实际应用中的进一步应用。
3.因此，提供一种能够针对微量rna样品进行环状rna鉴定的方法，对于环状rna的研究及应用具有重要意义。


技术实现要素：

4.发明目的：本发明的目的是提供一种可以精确用于微量样品的全长环状rna鉴定方法。
5.技术方案：所述微量样品的全长环状rna鉴定方法，包括如下步骤：
6.a)去除样品中的线性rna；
7.b)环状rna的全长逆转录；
8.c)全长逆转录产物扩增形成双链cdna；
9.d)去除核糖体基因序列；
10.e)富集去除核糖体后的全长逆转录产物；
11.f)构建长读长测序文库并测序，测序数据进行分析鉴定得到环状rna全长序列。
12.本发明创造性的点在于去除线性rna后，先进行逆转录形成稳定的双链cdna后，再进行核糖体基因序列的进一步去除，剩余cdna序列中即包含高比例的环状rna。
13.所述的微量样品至少含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100ng总rna。
14.所述的线性rna的去除采用rnase r进行。
15.所述的环状rna的全长逆转录采用具有末端转移酶活性和模板转换活性的逆转录酶进行，优选smartscribe逆转录酶。
16.所述的核糖体基因序列的去除，采用从双链cdna中去除核糖体序列方法进行，优选的采用dsn酶或者crispr-cas9技术进行。
17.所述的全长环状rna序列的鉴定，采用长读长测序技术进行测序，优选nanopore测序平台或pacbio测序平台。
18.有益效果：本发明与现有技术相比，具有如下优势：
19.1、本发明极大降低了所需要的样品量，提高了环状rna含量。
20.2、本发明可以结合短读长测序平台，进行常规的环状rna鉴定。
21.3、本发明能够解决现有鉴定环状rna方法要求起始rna量高的限制，能以纳克级别的总rna为起始进行环状rna的鉴定。
22.4、本发明的鉴定方法环状rna含量高、操作简便、耗时短，对于环状rna的认知及在样品稀有的临床应用中具有重要的应用前景。
附图说明
23.图1为本发明方法流程图。
具体实施方式
24.本实施例采用小鼠脑组织rna进行全长环状rna的鉴定，采用nanopore测序平台为例，对本发明进行进一步说明。实验方法：
25.1、将10ng样本rna溶于5μl无酶水中，65℃变性5min，置于冰上2min。
26.2、配置如下组分：
27.试剂体积(μl)变性的rna溶液5rnase r(20u/μl)0.110x reaction buffer1无酶水3.9总体积10
28.3、37℃孵育60min，采用rna磁珠进行纯化后，溶于8μl无酶水中。
29.4、上述rna中加入1μl逆转录引物，72℃变性3min，置于冰上2min。配置如下组分：
[0030][0031]
[0032]
5、在pcr仪中运行如下程序：
[0033]
步骤温度时间142℃90min270℃10min34℃保持
[0034]
6、在上述片逆转录反应液中加入如下组分：
[0035]
试剂体积(μl)2x q5 high-fidelity master mix25pcr引物5逆转录溶液20总体积50
[0036]
并在pcr仪中执行以下反应程序：
[0037] 步骤温度时间预变性198℃3min变性298℃15s退火360℃15s延伸472℃2min返回步骤2循环5次5
ꢀꢀ
延伸672℃5min保持74℃5min
[0038]
7、扩增产物经磁珠纯化后，溶于15μl无酶水中。
[0039]
8、在上述pcr产物中加入如下组分：
[0040][0041][0042]
9、在pcr仪中运行如下程序：
[0043]
步骤温度时间137℃60min272℃10min34℃保持
[0044]
10、反应结束后，在上述反应中加入如下组分：
[0045]
试剂体积(μl)上述反应液202x q5 high-fidelity master mix50pcr引物5无酶水25总体积100
[0046]
并在pcr仪中执行以下反应程序：
[0047] 步骤温度时间预变性198℃3min变性298℃15s退火360℃15s延伸472℃2min返回步骤2循环18次5
ꢀꢀ
延伸672℃5min保持74℃5min
[0048]
11、扩增产物经磁珠纯化后，根据常规nanopore dna文库构建流程进行文库构建并测序，测序结果中即含有高比例环状rna全长序列。
[0049]
实施例测序结果经过分析如下所示：
[0050][0051]
由上表可见：实施例可以在10ng样品中鉴定出37205个全长环状rna，支持反式剪切位点的reads数占全部测序reads数的14.48％，说明本发明的方法结果可靠，可以用于微量样品的全长环状rna鉴定。


技术特征：
1.一种微量样品的全长环状rna鉴定方法，其特征在于：包括如下步骤：a)去除样品中的线性rna；b)环状rna的全长逆转录；c)全长逆转录产物扩增形成双链cdna；d)去除核糖体基因序列；e)富集去除核糖体后的全长逆转录产物；f)构建长读长测序文库并测序，测序数据进行分析鉴定得到环状rna全长序列。2.根据权利要求1所述的微量样品的全长环状rna鉴定方法，其特征在于：所述样品至少含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100ng总rna。3.根据权利要求1所述的微量样品的全长环状rna鉴定方法，其特征在于：采用rnase r进行样品中的线性rna的去除。4.根据权利要求1所述的微量样品的全长环状rna鉴定方法，其特征在于：双链cdna的扩增方法，包括：采用具有末端转移酶活性和模板转换活性的逆转录酶得到全长环状rna的cdna。5.根据权利要求4所述的微量样品的全长环状rna鉴定方法，其特征在于：所述逆转录酶为smartscribe逆转录酶。6.根据权利要求1所述的微量样品的全长环状rna鉴定方法，其特征在于：以模板转换后得到的cdna为模板，采用dna聚合酶扩增得到双链cdna。7.根据权利要求6所述的微量样品的全长环状rna鉴定方法，其特征在于：所述dna聚合酶为高保真dna聚合酶pfu。8.根据权利要求6所述的微量样品的全长环状rna鉴定方法，其特征在于：采用dsn酶或者crispr-cas9技术进行双链cdna中的核糖体序列的去除。9.根据权利要求1所述的微量样品的全长环状rna鉴定方法，其特征在于：采用长读长测序技术进行全长环状rna鉴定。

技术总结
本发明公开了一种微量样品的全长环状RNA鉴定方法，步骤如下：a)去除样品中的线性RNA；b)环状RNA的全长逆转录；c)全长逆转录产物扩增形成双链cDNA；d)去除核糖体基因序列；e)富集去除核糖体后的全长逆转录产物；f)构建长读长测序文库并测序，测序数据进行分析鉴定得到环状RNA全长序列。本发明提供的全长环状RNA鉴定方法具有可用于微量样品的环状RNA鉴定、全长环状RNA序列比例高、操作容易等特点，可用于精确的全长环状RNA序列的获得。精确的全长环状RNA序列的获得。精确的全长环状RNA序列的获得。


技术研发人员：白云飞 卢文翔 李晓晗 葛芹玉
受保护的技术使用者：东南大学
技术研发日：2022.12.27
技术公布日：2023/3/14