一种海洋寡糖及其在促进异育银鲫免疫活性和延长草莓保鲜及储藏周期中的应用

本发明属于微生物领域和天然产物活性评价与应用，具体涉及一种海洋寡糖及其在促进异育银鲫免疫活性和延长草莓保鲜及储藏周期中的应用。

背景技术：

1、卡拉胶寡糖是卡拉胶的降解产物，与卡拉胶多糖相比具有良好的可溶性和生物利用度，因而卡拉胶寡糖的高效制备和活性评价成为海洋生物资源开发领域的研究热点。

2、异育银鲫隶属于鲤形目鲤科，是我国淡水鱼养殖品种之一，在淡水养殖业中占据十分重要的地位。然而随着环境的不断恶化，异育银鲫的多种细菌性疾病给其养殖业带来了巨大压力。通过饲料途径增强鱼体的免疫力、维护养殖鱼体生理健康是当下的研究热点。

3、草莓因为鲜嫩多汁且营养丰富而广受大众的喜爱。但是其柔软的果肉在采收后极易造成表面机械损伤，从而出现腐烂、霉变等不良变化。当前对草莓保鲜采取最常用的方法就是低温冷藏，但是较低的温度极易造成果蔬的冷害，且低温贮藏耗能大，需要建立冷链物流。参考文献：王文婷等，中草药提取物对草莓保鲜作用的初步评价，佳木斯大学学报(自认科学版)，第38卷第3期。

4、综上，近年来研究显示卡拉胶寡糖具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抑制血管生成等多种生物活性，但尚未有关于利用酶法制备具有促进异育银鲫免疫增强活性和延长草莓等蔬果保鲜期的的卡拉胶寡糖及其应用的报道。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种海洋寡糖。

2、本发明还要解决的技术问题是，提供上述海洋寡糖的制备方法。

3、本发明最后要解决的问题是提供上述海洋寡糖在促进异育银鲫免疫活性、延长草莓保鲜及储藏周期中的应用。

4、为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

5、一种海洋寡糖的制备方法，其特征在于，以卡拉胶为底物，利用重组卡拉胶酶cgka通过酶切的方式得到的包括二糖和四糖组成的海洋寡糖混合物；

6、其中，所述的重组卡拉胶酶cgka是以大肠杆菌bl21(de3)为宿主，在表达载体pet-21a(+)上插入产酶基因cgka获得的；所述的产酶基因cgka来源于土地杆菌pedobacterhainanensis nj-02，其核苷酸序列如seq id no.1所示，编码的氨基酸序列如seq id no.2所示。

7、其中，所述的卡拉胶为κ-卡拉胶。

8、其中，所述的海洋寡糖为κ-卡拉胶寡糖，包括κ-卡拉胶二糖和κ-卡拉胶四糖的混合物。

9、其中，所述的二糖和四糖的摩尔比为59:41。

10、上述海洋寡糖的制备方法，包括如下步骤：

11、(1)将浓度为1％g/ml的κ-卡拉胶溶液倒入反应器中反应，添加卡拉胶酶cgka直至底物完全降解，获得κ-卡拉胶寡糖混合液；

12、(2)将步骤(1)中得到的κ-卡拉胶寡糖混合液先冻干后透析除盐，再冻干后获得κ-卡拉胶寡糖混合物。

13、其中，步骤(1)中，所述的反应，其反应条件为：控制反应温度为30-40℃。

14、优选的，将浓度为1％g/ml的κ-卡拉胶溶液倒入可控温釜式反应器中反应，控制反应温度为35℃，每30min加入1000u卡拉胶酶直至底物完全降解，获得κ-卡拉胶寡糖混合液；卡拉胶酶的使用总量为1000u～10000u。

15、其中，底物完全降解以以下因素确定：通过dns法检测到还原糖含量不再上升时，则底物完全降解，即视为反应结束。

16、其中，步骤(2)中，所述的冻干后透析除盐，具体是通过冷冻干燥机冻干后透析除盐。

17、上述制备方法制备得到的海洋寡糖也在本发明所保护的范围之内。

18、上述海洋寡糖作为饲料添加剂在促进异育银鲫免疫活性中的应用也在本发明所保护的范围之内。

19、具体的，通过对草莓贮藏过程中硬度、腐败率、还原糖含量、vc含量、有机酸含量、可溶性固形物含量等参数的测定，研究κ-卡拉胶寡糖对草莓保鲜活性的影响。

20、实验结果表明，制备的κ-卡拉胶寡糖能有效延长草莓的保质期，降低草莓的腐败率。同时对草莓的相关营养风味物质包括维生素c(vc)、可溶性固形物、还原糖含量等有着较好的保持效果，且保鲜效果与寡糖浓度含量基本呈正相关关系。

21、上述海洋寡糖在延长草莓保鲜及储藏周期中的应用也在本发明所保护的范围之内。

22、其中，通过在异育银鲫的基础饲料中添加不同梯度的κ-卡拉胶寡糖，比较异育银鲫的存活率、增重率、饲料转化率、特定生长率、肥满度等指标，同时对异育银鲫进行尾静脉采血，检测血清生化指标(包括总蛋白，总胆固醇，甘油三酯，和高密度脂蛋白胆固醇)与非特异免疫指标(包括丙二醛，超氧化物歧化酶，溶菌酶，过氧化氢酶)，研究κ-卡拉胶寡糖对异育银鲫免疫活性的影响。

23、结果表明，κ-卡拉胶寡糖作为饲料添加剂饲喂异育银鲫，发现异育银鲫生长状况良好，病死率低，经免疫学实验验证发现血清超氧化物歧化酶与溶菌酶活性与寡糖的浓度呈现明显的剂量关系，在寡糖添加量为1％活性达到最大值，显著(p<0.05)高于diet1组。由此可以看出卡拉胶寡糖作为饲料添加剂可以显著提升实验鱼的非特异性免疫力。

24、有益效果：

25、(1)针对淡水经济鱼类养殖和草莓保鲜存在的问题，本发明提供一种对异育银鲫免疫活性具有促进作用和对草莓保鲜具有显著效果的卡拉胶寡糖的制备方法。设备简单，使用方便，同时全绿色的生产过程意味着该制剂具有巨大的发展前景。

26、(2)为开发新型果蔬保鲜剂和水产用免疫佐剂，本发明采用酶法降解得到卡拉胶寡糖为基础，制备了新型绿色的农用制剂。

27、(3)本发明涉及的卡拉胶寡糖展现出较好的果蔬保鲜作用和促进异育银鲫免疫活性的作用，具有很好的应用潜力和价值。

技术特征：

1.一种海洋寡糖的制备方法，其特征在于，以卡拉胶为底物，利用重组卡拉胶酶cgka通过酶切的方式得到的包括二糖和四糖组成的海洋寡糖混合物；

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的卡拉胶为κ-卡拉胶。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的海洋寡糖为κ-卡拉胶寡糖，包括κ-卡拉胶二糖和κ-卡拉胶四糖的混合物。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的二糖和四糖的摩尔比为59:41。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的反应，其反应条件为：控制反应温度为30-40℃。

7.权利要求1-6中任意一项所述的制备方法，制备得到的海洋寡糖。

8.权利要求7所述的海洋寡糖作为饲料添加剂在促进异育银鲫免疫活性中的应用。

9.权利要求7所述的海洋寡糖在延长草莓保鲜及储藏周期中的应用。

技术总结
本发明具体涉及一种海洋寡糖及其在促进异育银鲫免疫活性和延长草莓保鲜及储藏周期中的应用。本发明制备的寡糖主要包含κ‑卡拉胶二糖、κ‑卡拉胶四糖和κ‑卡拉胶六糖。对制备的寡糖进行延长草莓保鲜和储藏周期活性的评价，结果表明对草莓贮藏过程中硬度、腐败率、还原糖含量、维生素C(Vc)含量、有机酸含量、可溶性固形物有着较好的保持作用。同时，1％的卡拉胶寡糖可以显著的提高异育银鲫的存活率，降低异育银鲫血清中总胆固醇、甘油三酯的含量，提升高密度脂蛋白胆固醇的含量，增强血清中超氧化物歧化酶、过氧化氢酶以及溶菌酶的活性。本发明对挖掘新型卡拉胶水解酶作为生产寡糖的生物工具以及探索其水解产物的活性应用提供了极大的参考价值。

技术研发人员：朱本伟,郭子龙,姚忠,宁利敏,周明柱
受保护的技术使用者：南京工业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13