一种利用基因编辑改良大豆炸荚的方法与流程

本发明涉及分子生物学技术和基因工程领域，特别涉及一种利用基因编辑技术改良大豆炸荚的方法。

背景技术：

1、果荚开裂是豆类和十字花科作物种子传播的关键性状，在果荚类农作物生产过程中可导致显着的产量损失。一般果荚干燥后，导致果荚壁开裂的主要原因有：果荚壁结合强度的降低；果荚壁产生的开裂力。在大豆规模化机械生产过程中，果荚开裂是不可忽视的性状，在干旱和半干旱地区抗大豆果荚开裂性状至关重要。

2、果荚开裂的本质是由细胞分离现象造成的，细胞分离必然牵涉到细胞壁的软化和降解，而纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶通过调控纤维素、半纤维素和果胶的降解来影响细胞壁的组成，参与果荚的开裂。

3、现有技术中，文献《dehiscence-related expression of an arabidopsisthaliana gene encoding a polygalacturonase in transgenic plants of brassicanapus》(jenkins es,paul w,craze m,et al)中公开了在甘蓝型油菜中的果胶酶rdpg1和与之同源的拟南芥adpg1基因参与了花药和果荚开裂；文献《apple svp family mads-boxproteins and the tomato pedicel abscission zone regulator jointless havesimilar molecular activities》(nakano t,kato h,shima y,et al)公开了indehiscent(ind),hecate3(hec3)以及mads-box类的转录因子，通过调控adpg1和adpg2的在果荚开裂区域表达来调控果荚的开裂；文献《molecular basis of a shattering resistanceboosting global dissemination of soybean》(funatsuki h，suzuki m，hirose a，etal.)公开了pdh1基因编码一种参与木质化的dirigent(dir)家族蛋白，它通过促进干豆荚壁的扭转来增加开裂力，在栽培大豆中存在qpdh1突变体，是qpdh1基因的第31个氨基酸由aag突变为tag导致提前终止，出现抗裂荚性状。由此可见，虽然现有文献中已经公开了qpdh1基因与大豆炸荚有一定的关系，但是采用何种手段调控qpdh1基因以准确改良大豆炸荚的问题，目前还未有人进行深入体验。

技术实现思路

1、针对以上现有技术的不足，本发明提供了一种利用基因编辑改良大豆炸荚的方法，具体通过crispr-cas9基因编辑技术和大豆遗传转化技术实现。

2、本发明提供的利用基因编辑改良大豆炸荚的方法包括以下步骤：

3、s1、针对qpdh1基因表现型为裂荚的大豆品种，设计crispr/cas9系统靶点，为gcatgttgtggcctcttcactgg；

4、s2、构建大豆qpdh1基因编辑载体；

5、s3、利用遗传转化技术将所述大豆qpdh1基因编辑载体导入到大豆种子材料的基因组中，筛选获得qpdh1基因功能丧失的大豆品种。

6、优选的，所述大豆的品种为中豆40。

7、进一步地，所述步骤s2具体为，使用pegcas9pm4-b空载、引物qpdh1-tf和引物qpdh1-tr构建大豆qpdh1基因编辑载体，引物qpdh1-tf和引物qpdh1-tr的核苷酸序列为：

8、qpdh1-tf:attgcatgttgtggcctcttcac(如seq id no.4所示)；

9、qpdh1-tr:aaactgaagaggccacaacatgc(如seq id no.5所示)；

10、组装的具体方式为：取引物1μl qpdh1-tf、1μl qpdh1-tr、8μl无菌水，放入ep管中混匀，在pcr扩增仪上，先在95℃变性，再在55℃退火后，得到qpdh1引物混合液；再取1μlqpdh1引物混合液，与30ng pegcas9pm4-b空载、1μl 10×cutsmart buffer、35u t4 dna连接酶、10u bsal限制性内切酶和无菌水组成10μl混合体系，37℃培养1h；

11、连接完成的混合液转化进入dh5a大肠杆菌感受肽细胞中，经过菌检，测序确认，最终组成pegcas9pm4-b-qpdh1序列。

12、进一步地，所述pegcas9pm4-b空载的序列如seq id no.2所示，所述pegcas9pm4-b-qpdh1载体的序列如seq id no.3所示。

13、进一步地，步骤s3中，所述大豆遗传转化技术包括大豆种子灭菌、农杆菌eha105制备、大豆种子萌发、外植体准备、侵染和共培养、恢复培养、筛选和再生、生长培养。

14、一般情况下，在完成所述大豆遗传转化技术的步骤后，还可以提取经过基因编辑的大豆品种的基因组dna进行测序，验证大豆品种是否经过基因改良，以及基因的具体突变类型。

15、与现有技术相比，本发明的有益之处在于：本发明研究出crispr-cas基因编辑系统可以有效的改良因qpdh1裂荚基因型造成的大豆栽培品种“中豆40”的果荚开裂现象，解决在大豆大规模机械化生产应用中的关键问题，并探索出利用基因编辑技术进行大豆育种的可实施性。

技术特征：

1.一种利用基因编辑改良大豆炸荚的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种利用基因编辑改良大豆炸荚的方法，其特征在于，所述大豆的品种为中豆40。

3.根据权利要求2所述的一种利用基因编辑改良大豆炸荚的方法，其特征在于，步骤s2具体为，使用pegcas9pm4-b空载、引物qpdh1-tf和引物qpdh1-tr构建大豆qpdh1基因编辑载体，所述引物qpdh1-tf和引物qpdh1-tr的核苷酸序列为：

4.根据权利要求3所述的一种利用基因编辑改良大豆炸荚的方法，其特征在于，所述pegcas9pm4-b空载的序列如seq id no.2所示，所述pegcas9pm4-b-qpdh1载体的序列如seqid no.3所示。

5.根据权利要求1所述的一种利用基因编辑改良大豆炸荚的方法，其特征在于，步骤s3中，所述大豆遗传转化技术包括大豆种子灭菌、农杆菌eha105制备、大豆种子萌发、外植体准备、侵染和共培养、恢复培养、筛选和再生、生长培养。

技术总结
本发明公开了一种利用基因编辑技术改良大豆炸荚的方法，涉及分子生物学技术和基因工程领域；根据栽培大豆果荚成熟后易开裂表型以及通过分析鉴定出大豆可能是qPDH1基因表达造成的成熟果荚干燥后易开裂，以此构建了基因qPDH1的CRISPR/Cas9基因编辑载体，以及通过大豆的遗传转化技术，成功得到qPDH1被编辑的大豆植株，并获得了T1代的编辑苗，通过对T1代的大豆果荚干燥处理，发现被编辑的材料大豆果荚易开裂性状消失，有效地解决了大豆果荚易开裂的表型，对大豆规模化机械生产具有重要的意义。

技术研发人员：王高华,邹洪锋,段芳,谢先荣,刘伟智
受保护的技术使用者：武汉艾迪晶生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13