一种不扩增病毒核酸检测方法及其应用

本发明属于核酸检测，具体涉及一种不扩增病毒核酸检测方法及其应用。

背景技术：

1、病毒(biological virus)是一种非细胞生命形态体，其结构简单，由蛋白质外壳和遗传物质所组成，必须寄生在活细胞内以复制方式增殖。2019年由新型冠状病毒引起的疫情对每个人日常生活和全国公共卫生及经济发展造成了巨大影响。因此能否快速、准确、高通量的进行大范围病毒检测排查和控制继发性传播极为关键。常用病毒的检测技术有病毒核酸检测、igm抗体检测、中和抗体检测和病毒分离培养检测等，由于操作性和成本优势主要以病毒核酸检测为主，包括rna病毒核酸和dna病毒核酸检测，其中dna病毒核酸可以直接进行实时荧光定量pcr(qpcr)检测，rna病毒需要先逆转录成cdna然后在进行检测，常见dna病毒有人乳头瘤病毒、乙肝病毒等，rna病毒有艾滋病毒、新型冠状病毒等。

2、病毒快速检测一般情况不需要进行定量分析，定性检测就可以用于初步诊断。一些常见病毒，如hpv病毒等，在临床上并没有直接证说明病毒含量高低与病情严重程度、病情进展情况及用药剂量有直接关系，往往只需要检测结果展示阴性和阳性即可。传统qpcr病毒检测是以病毒核酸为模板，依靠靶向引物进行模板扩增和荧光探针(染料)将扩增信号逐级放大，进而反馈出病毒样本检测结果。在判定结果前需要先设定ct值的标准范围(一般情况为23-35ct值)和扩增曲线状况(标准s型曲线)，检测结果与预先设定的标准值进行比较从而判定检测样本的阴阳性。对于靶向引物不够特异、反应体系扩增效率和病毒核酸质量较差的情况容易出现高ct值，对于ct值超过标准值情况，需要判定扩增曲线形状和重新进行样本检测及重新判定结果。同时，对于扩增产物污染带来的假阳性，传统qpcr病毒检测无法消除。此外，传统qpcr病毒检测通过扩增曲线和ct值来判定结果，对于微流控芯片等大通量的微机电检测设备较难运用该技术。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种不扩增病毒核酸检测方法，解决了现有技术中时常需要依靠预先设定的标准曲线和ct值进行检测，导致检测速率慢的问题。

2、为了解决上述问题，本发明采用的技术方案是：一种不扩增病毒核酸检测方法，该方法为：依靠连续的两条长短引物与病毒核酸结合后，先形成稳定的引物与模板型式的pcr扩增结构，再在dna聚合酶的作用下以长链引物为模板进行扩增反应，并释放荧光信号，进而确定核酸检测结果。

3、优选地，该方法具体包括以下步骤：

4、s1、根据病毒核酸序列设计一条f1单链引物，所述f1单链引物的长度为145～155bp；

5、s2、根据病毒序列设计一条f2引物，所述f2引物的长为20～28bp；

6、s3、根据所述f1单链引物序列、所述f2引物序列分别设计t4探针和r3引物；

7、s4、在所述f2引物扩增延伸的作用下，dna聚合酶将所述f1单链引物上的探针t4切割释放荧光信号，确定核酸检测结果。

8、优选地，所述s1中，所述f1单链引物3’端与病毒核酸序列特异性结合，结合位点为5-30bp。

9、优选地，所述s1中，所述f1单链引物3’端以外的其它碱基序列要避免与病毒核酸序列配对结合，致使f1引物中间序列和5’端序列能够暴露在反应体系中。

10、优选地，所述s2中，所述f2引物5’端与病毒核酸特异性结合，结合位点为15～25bp；所述f2引物3’端与所述f1单链引物特异性结合，结合位点为3～6bp。

11、优选地，所述f1单链引物和所述f2引物与病毒核酸结合位点是连续结合位点。

12、优选地，所述s3中，所述t4探针结合位点为所述f1单链引物中间位置，所述r3引物是所述f1单链引物和所述f2引物形成pcr扩增结构后的下游引物。

13、本发明的另一个技术方案是这样实现的：一种上述的不扩增病毒核酸检测方法在非诊断目的的核酸快检中的应用。

14、优选地，所述核酸快检包括人体中的病毒核酸检测或环境中的病毒核酸检测。

15、与现有技术相比，本发明检测方法不需要对rna病毒核酸进行反转录反应获得cdna,直接就可以对dna和rna病毒核酸进行检测，简便病毒检测操作，节省检测成本和反应时间；本发明检测方法不对病毒核酸进行扩增反应，因此不会有扩增产物污染；本发明检测方法对病毒核酸特异性结合位点较多且为连续性结合位点，检测特异性高，极大程度上避免了由于检测试剂灵敏度过高出现的假阳性情况；本发明检测方法对病毒核酸结合位点为40-50bp连续碱基序列，因此对于病毒质量较差或者病毒核酸降解严重依然有很强的检测能力；本发明检测过程不需要依靠s型荧光扩增曲线来判定，能否检测到反应体系的荧光即可判定病毒检测结果，因此，本发明检测方法更容易适配微流控芯片等大通量的微机电检测设备的运用。

技术特征：

1.一种不扩增病毒核酸检测方法，其特征在于，该方法为：依靠连续的两条长短引物与病毒核酸结合后，先形成稳定的引物与模板型式的pcr扩增结构，再在dna聚合酶的作用下以长链引物为模板进行扩增反应，并释放荧光信号，进而确定核酸检测结果。

2.根据权利要求1所述的一种不扩增病毒核酸检测方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤：

3.根据权利要求1所述的一种不扩增病毒核酸检测方法，其特征在于，所述s1中，所述f1单链引物3’端与病毒核酸序列特异性结合，结合位点为5-30bp。

4.根据权利要求3所述的一种不扩增病毒核酸检测方法，其特征在于，所述s1中，所述f1单链引物3’端以外的其它碱基序列要避免与病毒核酸序列配对结合，致使f1引物中间序列和5’端序列能够暴露在反应体系中。

5.根据权利要求1所述的一种不扩增病毒核酸检测方法，其特征在于，所述s2中，所述f2引物5’端与病毒核酸特异性结合，结合位点为15～25bp；所述f2引物3’端与所述f1单链引物特异性结合，结合位点为3～6bp。

6.根据权利要求1所述的一种不扩增病毒核酸检测方法，其特征在于，所述f1单链引物和所述f2引物与病毒核酸结合位点是连续结合位点。

7.根据权利要求1所述的一种不扩增病毒核酸检测方法，其特征在于，所述s3中，所述t4探针结合位点为所述f1单链引物中间位置，所述r3引物是所述f1单链引物和所述f2引物形成pcr扩增结构后的下游引物。

8.一种权利要求1-7任意一项所述的不扩增病毒核酸检测方法在非诊断目的的核酸快检中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述核酸快检包括人体中的病毒核酸检测或环境中的病毒核酸检测。

技术总结
本发明公开了一种不扩增病毒核酸检测方法及其应用，其中，检测该方法为：依靠连续的两条长短引物与病毒核酸结合后，先形成稳定的引物与模板型式的PCR扩增结构，再在DNA聚合酶的作用下以长链引物为模板进行扩增反应，并释放荧光信号，进而确定核酸检测结果。本发明检测方法不需要对RNA病毒核酸进行反转录反应获得cDNA,直接就可以对DNA和RNA病毒核酸进行检测，简便病毒检测操作，节省检测成本和反应时间；本发明检测方法不对病毒核酸进行扩增反应，因此不会有扩增产物污染；本发明检测方法对病毒核酸特异性结合位点较多且为连续性结合位点，检测特异性高，极大程度上避免了由于检测试剂灵敏度过高出现的假阳性情况。

技术研发人员：许万里,孔凤鸣,徐亮亮,张艳,赵彩宁,梁芷冰
受保护的技术使用者：香港大学深圳医院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13