槐耳中甾体类化合物及其制备方法和应用

：本发明属于医药，具体涉及一种从槐耳中制备具有酪氨酸酶抑制活性的甾体类化合物及其制备方法及所述化合物在治疗黑色素瘤中的应用。

背景技术

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背景技术：

1、黑色素瘤(mm)是一种由黑色素细胞转变来的恶性肿瘤，威胁人类的健康，大多数患者的临床预后较差，晚期患者的生存时间较短。酪氨酸酶抑制剂可通过抑制酪氨酸酶的活性，减少黑色素在皮肤内的生成量，有的抑制剂可作为三磷酸腺苷(atp)与酪氨酸激酶结合的竞争性抑制剂，也可作为酪氨酸的类似物，阻断酪氨酸激酶的活性，抑制细胞增殖。目前，随着医学技术和现代分子技术的蓬勃发展，对于mm首选的治疗方法仍然是手术切除原发病灶，不过依然存在术后易复发，易产生耐药性，治疗成本高等缺点。天然药物已有数千年临床使用的经验，是治疗疾病的有效途径之一，因此从天然产物中寻找治疗黑色素瘤的先导性化合物具有重要意义。

2、槐耳的学名为槐生拜尔孔菌，别名有槐檽、槐菌等，拉丁文名为vanderbyliarobiniophila(murrill)b.k.cui&y.c.dai，隶属于担子菌门(basidiomycetes)伞菌纲(agaricomycetes)多孔菌目(polyporales)多孔菌科(polyporaceae)vanderbylia属，主要分布在辽宁、陕西、山东、河北等地。槐耳始见于1500年前《肘后方》，入药已有1400余年历史，是我国名贵中药草，用于止血、止痢等。近年来，随着槐耳良好的抗癌疗效与极低的毒副作用得到临床的广泛认可，对槐耳化学成分的报道也日益增多。槐耳在作为恶性肿瘤治疗的补充替代药物中具有广阔的应用前景。

技术实现思路

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技术实现要素：

1、本发明的目的在于提供一种从槐耳中制备具有酪氨酸酶抑制活性的甾体类化合物及其制备方法及所述化合物在治疗黑色素瘤中的应用。

2、为实现本发明的目的，采用的制备技术方案如下所述：

3、一种槐耳中甾体类化合物，化合物1(isocyathisterol)和2(7α-methoxy-5α,6α-epoxyergosta-8(14),22-diene-3β-triol)结构式依次如下1、2所示:

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5、所述的槐耳中甾体类化合物的制备方法，以多孔菌科(polyporaceae)、vanderbylia属真菌——槐耳为原料，进行固体发酵得到发酵产物，经乙醇浸泡提取、乙酸乙酯萃取得到浸膏，萃取后经色谱分离纯化，进而分别获得化合物1和化合物2。

6、所述槐耳(vanderbyliarobiniophila(murrill)，目前该菌株已由诸多文章进行报道并且可市售获得。例如，fungal diversity,97:137-392(2019)。

7、进一步的说：

8、(1)扩大培养：将槐耳菌丝体接入ma培养基，培养7天；

9、(2)发酵：收集扩大培养槐耳菌丝接入大米固体培养基中，培养45天，得到发酵产物；

10、(3)回流提取：工业乙醇浸提发酵产物，再减压浓缩蒸馏，得到浸膏a；

11、(4)萃取：将浸膏a分散在蒸馏水中，采用乙酸乙酯反复萃取，得到浸膏b；

12、(5)色谱分离：所得浸膏b经减压硅胶柱层析，依次经体积比为100:1～1:1的石油醚-乙酸乙酯和体积比为100:1～1:1的二氯甲烷-甲醇流动相梯度洗脱，收集8：1-3：1的石油醚-乙酸乙酯洗脱液组分进行硅胶柱层析，经体积比为50:1～1:1的石油醚-乙酸乙酯进行梯度洗脱，收集10:1-8:1馏分；将所收集馏份经制备型hplc，甲醇/水系统洗脱，收集62～65min的色谱峰，所得样品再经半制备型hplc，乙腈/水系统洗脱，收集72～77min的色谱峰，得到化合物1；

13、收集经减压硅胶柱层析1:1的石油醚-乙酸乙酯洗脱液馏分，进行ods反相柱层析，采用工业乙醇流动相10％～90％梯度洗脱，收集80％-90％馏分进行硅胶柱层析，依次经体积比为20:1～1:1石油醚-乙酸乙酯和100:1～1:1的二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，收集8:1-3:1的二氯甲烷-甲醇洗脱液馏份经制备型hplc，甲醇/水系统洗脱，收集53～56min的色谱峰，所得样品再经半制备型hplc，乙腈/水系统洗脱，收集48～51.5min的色谱峰，得到化合物2。

14、所述ma培养基的组分为：麦芽浸粉20g/l，琼脂12g/l，蒸馏水1l，ph自然；

15、所述大米培养基的组分为：大米120g/瓶，蒸馏水120ml/瓶，每个玻璃瓶容量为400ml，ph自然。

16、所述化合物1的制备型hplc分离的甲醇/水洗脱时甲醇/水体积比为93:7，所述化合物1的半制备型hplc分离的乙腈/水洗脱时乙腈/水体积比为90:10；

17、所述化合物2的制备型hplc分离的甲醇/水洗脱时甲醇/水体积比为90:10，所述化合物2的半制备型hplc分离的乙腈/水洗脱时乙腈/水体积比为90:10。

18、一种药物组合物，包括所述的甾体类化合物、药学上可接受的赋形剂或和载体。

19、一种所述化合物的应用，所述甾体类化合物或所述的药物组合物，在制备抗黑色素瘤药物中的应用。

20、本发明所具有的优点：

21、本发明获得的化合物是首次从槐耳中分离得到，为所述化合物的制备提供了新的方法，且方法简单、纯度较高。本发明首次发现该化合物具有较好的抗酪氨酸酶活性。其中化合物1对酪氨酸酶的ic50为25.46±3.86μm，化合物2对酪氨酸酶的ic50为31.58±4.65μm，其活性优于阳性药熊果苷(ic50为58.17±6.09μm)。化合物1和2可作为抗黑色素瘤的先导性化合物，为治疗此类疾病提供科学依据和新的思路。

技术特征：

1.一种槐耳中甾体类化合物，其特征在于：化合物1(isocyathisterol)和2(7α-methoxy-5α,6α-epoxyergosta-8(14),22-diene-3β-triol)结构式依次如下1、2所示:

2.按权利要求1所述的槐耳中甾体类化合物的制备方法，其特征在于：以多孔菌科(polyporaceae)、vanderbylia属真菌——槐耳为原料，进行固体发酵得到发酵产物，经乙醇浸泡提取、乙酸乙酯萃取得到浸膏，萃取后经色谱分离纯化，进而分别获得化合物1和化合物2。

3.按权利要求2所述的制备方法，其特征在于：

4.按权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述ma培养基的组分为：麦芽浸粉20g/l，琼脂12g/l，蒸馏水1l，ph自然；

5.按权利要求3所述的制备方法，其特征在于：

6.一种药物组合物，其特征在于，包括权利要求1所述的甾体类化合物、药学上可接受的赋形剂或和载体。

7.一种权利要求1所述化合物的应用，其特征在于：所述权利要求1所示甾体类化合物或权利要求6所述的药物组合物，在制备抗黑色素瘤药物中的应用。

技术总结
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种从槐耳中制备具有酪氨酸酶抑制活性的甾体类化合物及其制备方法及所述化合物在治疗黑色素瘤中的应用。化合物1(isocyathisterol)和2(7α‑methoxy‑5α,6α‑epoxyergosta‑8(14),22‑diene‑3β‑triol)结构式依次如下1、2所示。本发明获得的化合物是首次从槐耳中分离得到，为所述化合物的制备提供了新的方法，且方法简单、纯度较高。本发明首次发现该化合物具有较好的抗酪氨酸酶活性。其中化合物1对酪氨酸酶的IC50为25.46±3.86μM，化合物2对酪氨酸酶的IC50为31.58±4.65μM，其活性优于阳性药熊果苷(IC50为58.17±6.09μM)。化合物1和2可作为抗黑色素瘤的先导性化合物，为治疗此类疾病提供科学依据和新的思路。

技术研发人员：袁海生,王雨曦,贾景辉,魏玉莲,秦问敏
受保护的技术使用者：中国科学院沈阳应用生态研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13