β‐甘露聚糖酶突变体β‐ManM及其与胆汁酸制备的添加剂和应用的制作方法

本发明属于基因工程领域，具体涉及β-甘露聚糖酶突变体β-manm及其与胆汁酸制备的添加剂和应用。

背景技术：

1、甘露聚糖是植物半纤维素的主要成分，主要存在于软木植物及一些特殊结构，如植物种子中，是多种植物、微生物细胞壁的主要组成成分，也是自然界中含量仅次于木聚糖的半纤维素。由于甘露聚糖的多样性与结构的复杂性，它的完全水解需要多种酶的协同作用才能完成，包括内切-β-甘露聚糖酶、外切-β-甘露糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、乙酰甘露聚糖酯酶和α-半乳糖苷酶等。其中，内切-β-甘露聚糖酶能够降解甘露聚糖主链的β-1,4-糖苷键，是甘露聚糖降解过程中发挥最重要作用的酶。

2、β-甘露聚糖酶(ec 3.2.1.78)能够随机水解甘露聚糖的β-1,4-甘露糖苷键，产生低分子量的甘露寡糖。β-甘露聚糖酶能够降低甘露聚糖的抗营养因子作用，且降解产物甘露寡糖，能够促进乳酸菌和双歧杆菌的生长，利于动物肠道健康。然而，目前市场上的大多甘露聚糖酶在耐热性及酶活力等方面并不理想，另外，国内外市场上β-甘露聚糖酶因为酶活低、产量小，产品的相对价格很高，限制了其应用范围，因此，该问题急需解决。

3、微生物是酶最主要的生产来源，而细菌产的β-甘露聚糖酶比真菌来源的温度稳定性更好，尤其是以地衣芽孢杆菌等来源的甘露聚糖酶，但该酶在地衣芽孢杆菌产量低，难于满足市场需求。

技术实现思路

1、为了解决背景技术中的问题，本发明提供了β-甘露聚糖酶突变体β-manm及其与胆汁酸制备的添加剂和应用。所述的β-甘露聚糖酶突变体β-manm1、β-manm2、β-manm3具有更好的热稳定性，与胆汁酸混合后制得的添加剂在水产养殖中具有很好的增重效果。

2、为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

3、本发明提供了β-甘露聚糖酶突变体β-manm，其氨基酸序列如seq id no：3所示、或者如seq id no：5所示、或者如seq id no：7所示。

4、进一步的，所述β-甘露聚糖酶突变体β-manm具体为由氨基酸序列为seq id no：1所示的甘露聚糖酶的第68位的酪氨酸变为甲硫氨酸得到的甘露聚糖酶突变体β-manm1。

5、进一步的，所述β-甘露聚糖酶突变体β-manm具体还为由氨基酸序列为seq id no：1所示的甘露聚糖酶的第68位的酪氨酸变为甲硫氨酸以及第97位的甘氨酸变为半胱氨酸得到甘露聚糖酶突变体β-manm2；由氨基酸序列为seq id no：1所示的甘露聚糖酶的第68位的酪氨酸变为甲硫氨酸以及第273位的天冬酰胺变为脯氨酸得到的甘露聚糖酶突变体β-manm3。

6、本发明提供了一种编码所述的β-甘露聚糖酶突变体β-manm的基因，其核苷酸序列如seq id no：4所示、或者如seq id no：6所示、或者如seq id no：8所示。

7、本发明提供了一种包含所述的基因的重组工程菌株。

8、本发明提供了一种包含所述的β-甘露聚糖酶突变体β-manm的添加剂，其中还包含胆汁酸。

9、进一步的，所述添加剂是由含β-甘露聚糖酶突变体β-manm的重组工程菌株发酵制得的发酵液与胆汁酸以3～5:1的体积比混合而成的。

10、本发明提供了所述的β-甘露聚糖酶突变体β-manm或者所述的添加剂在水产养殖中的应用。

11、进一步的，所述β-甘露聚糖酶突变体β-manm或者添加剂的用量为水产动物基础日粮重量的0.02％～0.1％.

12、进一步的，所述水产动物为淡水鱼、虾和蟹。

13、与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：

14、本发明将来源于地衣芽孢杆菌的甘露聚糖酶β-man(genbank:gq859482.1)作为基础进行突变改良，通过筛选获得了突变位点分别为单点突变y68m的甘露聚糖酶突变体β-manm1，双点突变y68m/g97c的甘露聚糖酶突变体β-manm2以及和y68m/n273p的甘露聚糖酶突变体β-manm3。和原始基因相比，本发明得到的甘露聚糖酶突变体的热稳定性分别提高了32.5％、35.0％、50％，并且产酶水平达到12800万u/ml。本发明还利用含甘露聚糖酶β-man的工程菌发酵得到的发酵液与胆汁酸进行复配，将其用于水产养殖中，不仅能够明显提高鱼苗的增重率，也能降低其饵料系数，且添加剂成本低，非常有利于水产养殖。

技术特征：

1.β-甘露聚糖酶突变体β-manm，其特征在于，所述β-甘露聚糖酶突变体β-manm的氨基酸序列如seq id no：3所示、或者如seq id no：5所示、或者如seq id no：7所示。

2.根据权利要求1所述的β-甘露聚糖酶突变体β-manm，其特征在于，所述β-甘露聚糖酶突变体β-manm具体为由氨基酸序列为seq id no：1所示的甘露聚糖酶的第68位的酪氨酸变为甲硫氨酸得到的甘露聚糖酶突变体β-manm1。

3.根据权利要求1所述的β-甘露聚糖酶突变体β-manm，其特征在于，所述β-甘露聚糖酶突变体β-manm具体还为由氨基酸序列为seq id no：1所示的甘露聚糖酶的第68位的酪氨酸变为甲硫氨酸以及第97位的甘氨酸变为半胱氨酸得到甘露聚糖酶突变体β-manm2；由氨基酸序列为seq id no：1所示的甘露聚糖酶的第68位的酪氨酸变为甲硫氨酸以及第273位的天冬酰胺变为脯氨酸得到的甘露聚糖酶突变体β-manm3。

4.一种编码权利要求1-3任一项所述的β-甘露聚糖酶突变体β-manm的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如seq id no：4所示、或者如seq id no：6所示、或者如seq idno：8所示。

5.一种包含权利要求4所述的基因的重组工程菌株。

6.一种包含权利要求1所述的β-甘露聚糖酶突变体β-manm的添加剂，其特征在于，所述添加剂中还包含胆汁酸。

7.根据权利要求6所述的添加剂，其特征在于，所述添加剂是由含β-甘露聚糖酶突变体β-manm的重组工程菌株发酵制得的发酵液与胆汁酸以3～5:1的体积比混合而成的。

8.权利要求1所述的β-甘露聚糖酶突变体β-manm或者权利要求6所述的添加剂在水产养殖中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述β-甘露聚糖酶突变体β-manm或者添加剂的用量为水产动物基础日粮重量的0.02％～0.1％。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述水产动物为淡水鱼、虾和蟹。

技术总结
本发明公开了β‑甘露聚糖酶突变体β‑ManM及其与胆汁酸制备的添加剂和应用。本发明将来源于地衣芽孢杆菌的甘露聚糖酶β‑Man进行突变，通过筛选获得了氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示的甘露聚糖酶突变体β‑ManM1、氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示的β‑ManM2以及氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示的β‑ManM3，并在枯草芽孢杆菌中进行高效分泌表达。和原始基因相比，本发明的甘露聚糖酶突变体热稳定性分别提高了32.5％、35.0％、50％，且与胆汁酸混合得到的添加剂不仅成本低，且能够明显提高鱼苗的增重率和降低其饵料系数，非常有利于水产养殖。

技术研发人员：张西雷,娄倩倩,曹爱智,曹长明,赵建波
受保护的技术使用者：山东龙昌动物保健品有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13