一种结合SARS-CoV-2RBD的鲨鱼源单域抗体及其制备方法和应用

本发明属于基因工程，具体涉及一种结合sars-cov-2 rbd的鲨鱼源单域抗体及其制备方法和应用。

背景技术：

1、冠状病毒隶属于冠状病毒科、冠状病毒属，是一类单链正义rna病毒。sars-cov-2属于冠状病毒。冠状病毒基因组依次编码突刺蛋白(spike protein)、包膜蛋白(envelopeprotein)、膜蛋白(membrane protein)和核衣壳蛋白(nucleocapsid)。其中突刺蛋白(spike protein)是冠状病毒最重要的表面膜蛋白，含有两个亚基s1和s2。其中s1主要包含有受体结合区(receptorbinding domain，rbd)，负责识别细胞的受体；sars-cov-2通过其表面突刺蛋白(spike)的受体结合区域(rbd)与上皮细胞表面的血管紧张素转换酶2(ace2)结合后进入细胞，完成侵染。

2、鲨鱼源单域抗体vnar(variable new antigen receptor)衍生于其体内一种特殊的免疫球蛋白-重链抗体ignar(ig new antigen receptor)，是能够结合抗原的最小抗体片段，其分子量约为12-18kda。鲨鱼源单域抗体在亲和力和特异性上可对标传统单克隆抗体，且具备理化稳定性高，组织渗透性好、抗逆性强、稳定性高、易于改造的优点。同时，在生产方面，vnar原核细胞或酵母表达系统即可大量表达，不仅生产周期短，且生产成本经济低廉。目前，尚无sars-cov-2 rbd的鲨鱼源单域抗体用于新冠病毒感染的检测或预防。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题，本发明提供一种结合sars-cov-2 rbd的鲨鱼源单域抗体的制备方法，同时将用于sars-cov-2病毒的检测或预防。

2、本发明的技术方案如下：

3、本发明提供一种结合sars-cov-2 rbd的鲨鱼源单域抗体，所述单域抗体的氨基酸序列如seq id no:2或seq id no:4所示。

4、此外，本发明还提供编码上述单域抗体的核苷酸，其核苷酸序列如seq idno:1或seq id no:3所示。

5、本发明还提供一种结合sars-cov-2 rbd的鲨鱼源单域抗体的制备方法，具体包括如下步骤：

6、s1、以条纹斑竹鲨作为免疫对象，采用sars-cov-2 rbd的重组蛋白为抗原进行免疫；在完成多次免疫后，提取免疫鲨鱼外周血淋巴细胞的总rna，逆转录为cdna，以cdna为模板，扩增vnar基因片段；

7、s2、将纯化后的vnar基因片段插入噬菌粒载体pcomb3xss，构建重组噬菌粒载体，将重组噬菌粒载体转化e coli tg-1细胞，扩大培养后，通过辅助噬菌体vcs-m13感染，获得噬菌体抗体库；

8、s3、对噬菌体抗体库进行淘筛，获得阳性克隆，分别命名为s-rbd-55和s-rbd-61，并对其基因序列进行测序分析；

9、s4：扩增s-rbd-55和s-rbd-61所含vnar基因片段，将其克隆入表达载体pet30a，构建重组表达载体，将重组表达载体转化e coli shuffle t7细胞，筛选出阳性菌株后，扩大培养后加入诱导剂诱导表达，收集纯化抗体蛋白，即sars-cov-2 rbd的单域抗体。

10、本发明进一步提供结合sars-cov-2 rbd的鲨鱼源单域抗体在制备预防、治疗和/或诊断sars-cov-2感染的试剂盒或药物中的用途。

11、本发明进一步提供结合sars-cov-2 rbd的鲨鱼源单域抗体在制备预防sars-cov-2感染的喷雾中的应用。

12、本发明还进一步提供了一种预防sars-cov-2感染的喷雾，包括以下质量百分比的成分：

13、

14、

15、进一步的，所述抗菌剂为乙醇或银离子抑菌剂；所述稳定剂多聚磷酸钠、过碳酸钠或亚硫酸钠；所述分散剂为十二烷基苯磺酸钠。

16、相较于现有技术，本发明的有益效果在于：

17、1、本发明提供了可结合sars-cov-2 rbd蛋白的鲨源单域抗体，经elisa鉴定，所制备2株单域抗体对sars-cov-2 rbd蛋白结合的亲和力良好，其ic50分别为1.826±0.03nm和2.107±0.045nm；

18、2、本发明制得可结合sars-cov-2 rbd蛋白的鲨源单域抗体的经储存稳定性实验鉴定，在常温至50℃之间具有良好的稳定性；经圆二色谱鉴定，其半溶解温度均在75℃以上，这使得本发明的单域抗体可以摆脱冷链运输，并有效降低运输和储存成本；因此，本发明制得可结合sars-cov-2 rbd蛋白的鲨源单域抗体在开发新冠病毒消杀喷雾和新冠病毒抗原检测试剂盒都有较好的应用前景。

技术特征：

1.一种结合sars-cov-2rbd的鲨鱼源单域抗体，其特征在于，所述单域抗体的氨基酸序列如seq id no:2或seq id no:4所示。

2.一种编码如权利要求1所述的鲨鱼源单域抗体的核苷酸，其特征在于，核苷酸序列如seq id no:1或seq id no:3所示。

3.一种如权利要求1所述的结合sars-cov-2rbd的鲨鱼源单域抗体的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

4.一种如权利要求1所述的结合sars-cov-2rbd的鲨鱼源单域抗体在制备预防、治疗和/或诊断sars-cov-2感染的试剂盒或药物中的用途。

5.一种如权利要求1所述的结合sars-cov-2rbd的鲨鱼源单域抗体在制备预防sars-cov-2感染的喷雾中的应用。

6.一种预防sars-cov-2感染的喷雾，其特征在于，包括以下质量百分比的成分：

7.如权利要求6所述的一种预防sars-cov-2感染的喷雾，其特征在于，所述抗菌剂为乙醇或银离子抑菌剂；所述稳定剂多聚磷酸钠、过碳酸钠或亚硫酸钠；所述分散剂为十二烷基苯磺酸钠。

技术总结
本发明公开了一种结合SARS‑CoV‑2RBD的鲨鱼源单域抗体，所述单域抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示；编码上述鲨鱼源单域抗体的核苷酸，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示；本发明还提供结合SARS‑CoV‑2RBD的鲨鱼源单域抗体的制备方法，依次通过免疫、构建噬菌体抗体库、对噬菌体抗体库进行淘选获得阳性克隆、最终扩大培养后加入诱导剂诱导表达，收集纯化抗体蛋白获得鲨鱼源单域抗体；本发明制得的鲨鱼源单域抗体在开发新冠病毒消杀喷雾和新冠病毒抗原检测试剂盒都有较好的应用前景。

技术研发人员：程云英,郭玏,陈建明,叶雯,陈锦霖,曾妍媛
受保护的技术使用者：闽江学院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12