一种水稻茎单细胞原生质体的提取方法和应用与流程

本发明涉及植物原生质体提取，尤其涉及一种水稻茎单细胞原生质体的提取方法和应用。

背景技术：

1、单细胞转录组测序技术能够在单细胞分辨率下研究样本的转录组信息，可以完美解决细胞异质问题，能全面真实揭示细胞多样性和复杂性，在细胞类型、复杂细胞生物学进程解析、癌症和疾病发生机制探索等方面发挥重要作用。近年来，单细胞测序在植物上的应用也逐渐推广，植物单细胞转录组测序从不同层面对细胞发育、细胞功能及基因网络调控等方向进行深入研究探索，打开了我们对植物细胞真实的微观世界认知的大门。

2、植物细胞外面有一层坚硬的细胞壁，起着保护和支撑作用。植物细胞壁不易破坏分解，植物组织需要通过酶解消化掉细胞外面的一层细胞壁，解离成原生质体才能开展单细胞测序。由于植物中各种组织类型细胞壁的组成不同，破壁所需要的酶类型及浓度和其他反应条件不同，需要采用有针对性的原生质体制备方法。

3、专利号为cn113621552a、cn113046291a和cn114058564a的发明专利公开了紫花苜蓿根部细胞、亚洲棉根尖细胞、艾草叶片组织的原生质体提取方法，虽然水稻与紫花苜蓿、棉花、艾草同属于植物，但是由于生存于不同的环境中，植物通常表现出截然不同的生长发育特性，造成了水稻茎细胞与紫花苜蓿根部细胞、亚洲棉根尖细胞、艾草叶片组织细胞在生理生化、结构、功能等方面均具有非常大的差异，适用于紫花苜蓿根部细胞、亚洲棉根尖细胞、艾草叶片组织原生质体提取的方法在水稻茎细胞中不能有效发挥功能，亟需开发一种适用于水稻茎组织原生质体的提取方法。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提出了一种适用于水稻茎组织原生质体的提取方法和应用。

2、本发明的技术方案是这样实现的：第一，本发明提供了一种水稻茎单细胞原生质体的提取方法，包括如下步骤：

3、s1，水稻培养

4、取水稻成熟种子，经消毒处理后，培养至孕穗分化期；

5、s2，水稻茎预处理

6、取培育好的水稻，并将水稻茎节切成0.5-1mm长度，用d-山梨醇溶液浸泡10-20min；

7、s3，酶解

8、取浸泡好的茎节加入到酶解液中进行酶解，酶解时间为3-5h；所述酶解液包括纤维素酶rs、离析酶r-10、蜗牛酶、d-山梨醇、mes、kcl、cacl2和bsa；

9、s4，原生质体释放

10、向酶解液中加入等体积原生质体释放液，轻摇释放原生质体；

11、s5，分离

12、将酶解液和原生质体释放液的混合液过滤，离心分离，得到原生质体。

13、在以上技术方案的基础上，优选的，所述酶解液的配方为：1％-3％纤维素酶rs、0.5％-2％离析酶r-10、0.5％-1％蜗牛酶、80-95g/l d-山梨醇、20-30mmol/l mes、10-20mmol/l kcl、10-20mmol/l cacl2、0.1％-0.5％bsa，溶剂为去离子水，ph为5-6；所述酶解液使用前需要采用孔径为0.2-0.3μm的混合纤维素滤膜过滤除菌。

14、在以上技术方案的基础上，优选的，酶解时需在25-28℃避光条件下，以50-70rpm/min转速酶解3-5h。

15、在以上技术方案的基础上，优选的，步骤s5中离心分离方法为：利用孔径为70μm的细胞过滤器过滤混合液，去掉残余组织后，将上清液置于离心管中，利用300g离心力在4℃下离心5min，弃上清液后，经过2次原生质体释放液重悬和离心后，再重悬，然后置于冰上30min，利用孔径为40μm的细胞过滤器过滤，再次离心去掉上清液。

16、在以上技术方案的基础上，优选的，步骤s5离心分离后用含有d-山梨醇的w1溶液2次重悬细胞和离心，清洗ca2+，再次重悬即可获得原生质体。

17、在以上技术方案的基础上，优选的，所述原生质体释放液的配方为：80-95g/l d-山梨醇、20-25mmol/l mgcl2、4-6mmol/lmes和0.1％-0.3％bsa，溶剂为去离子水，ph为5-6。

18、在以上技术方案的基础上，优选的，所述w1溶液的配方为80-95g/l d-山梨醇、3-5mmol/lmes和15-25mmol/lkcl，溶剂为去离子水，ph为5-6。

19、在以上技术方案的基础上，优选的，水稻茎节选取水稻第一剑叶位置的茎节。

20、第二，本发明提供了水稻茎单细胞原生质体的提取方法所提取的原生质体。

21、第三，本发明提供了原生质体在单细胞转录组测序中的应用。

22、本发明的一种水稻茎单细胞原生质体的提取方法和应用相对于现有技术具有以下有益效果：

23、(1)蜗牛酶是一种混合酶，可以使植物组织解离出更多的原生质体；d-山梨醇起到维持细胞渗透压的作用，同时还可被细胞部分吸收利用维持生存。两者协同作用，可以获得更多的活性原生质体，降低细胞裂解的碎片率；同时山梨醇作为多元醇还能起到降低细胞结团的效果。

24、(2)本发明通过对酶解液、酶解时间、原生质体清洗步骤进行优化，得到一套高效分离、高活力及高数量水稻茎原生质体制备的体系和方法，0.2g水稻茎可以制备出约5×105个原生质体，与现有技术相比，具有原生质体活率高(≥95％)，碎片率低(小于5％)和结团率低(小于3％)的优点，为后续进行单细胞测序实验提供了充足的材料。

技术特征：

1.一种水稻茎单细胞原生质体的提取方法，其特征在于：包括如下步骤：

2.如权利要求1所述的一种水稻茎单细胞原生质体的提取方法，其特征在于：所述酶解液的配方为：1％-3％纤维素酶rs、0.5％-2％离析酶r-10、0.5％-1％蜗牛酶、80-95g/ld-山梨醇、20-30mmol/lmes、10-20mmol/lkcl、10-20mmol/lcacl2、0.1％-0.5％bsa，溶剂为去离子水，ph为5-6；所述酶解液使用前需要采用孔径为0.2-0.3μm的混合纤维素滤膜过滤除菌。

3.如权利要求1所述的一种水稻茎单细胞原生质体的提取方法，其特征在于：酶解时需在25-28℃避光条件下，以50-70rpm/min转速酶解2-5h。

4.如权利要求1所述的一种水稻茎单细胞原生质体的提取方法，其特征在于：步骤s5的离心分离方法为：利用孔径为70μm的细胞过滤器过滤混合液，去掉残余组织后，将上清液置于离心管中，利用300g离心力在4℃下离心5min，弃上清液后，经过2次原生质体释放液重悬和离心后，再重悬，然后置于冰上30min，利用孔径为40μm的细胞过滤器过滤，再次离心去掉上清液。

5.如权利要求4所述的一种水稻茎单细胞原生质体的提取方法，其特征在于：步骤s5离心分离后用含有d-山梨醇的w1溶液2次重悬细胞和离心，清洗ca2+，然后再次重悬即可获得原生质体。

6.如权利要求4所述的一种水稻茎单细胞原生质体的提取方法，其特征在于：所述原生质体释放液的配方为：80-95g/ld-山梨醇、20-25mmol/lmgcl2、4-6mmol/lmes和0.1％-0.3％bsa，溶剂为去离子水，ph为5-6。

7.如权利要求5所述的一种水稻茎单细胞原生质体的提取方法，其特征在于：所述w1溶液的配方为80-95g/ld-山梨醇、3-5mmol/lmes和15-25mmol/lkcl，溶剂为去离子水，ph为5-6。

8.如权利要求1所述的一种水稻茎单细胞原生质体的提取方法，其特征在于：水稻茎节选取水稻第一剑叶位置的茎节。

9.如权利要求1-8任一项所述的提取方法所提取的原生质体。

10.如权利要求9所述的原生质体在单细胞转录组测序中的应用。

技术总结
本发明提出了一种水稻茎单细胞原生质体的提取方法和应用，其中提取方法包括如下步骤：S1，取水稻成熟种子，经消毒处理后，培养至孕穗分化期；S2，取培育好的水稻，并将水稻茎节切成0.5‑1mm长度，用D‑山梨醇溶液浸泡10‑20min；S3，取浸泡好的茎节加入到酶解液中进行酶解，酶解时间为3‑5h；S4，向酶解液中加入等体积原生质体释放液，轻摇释放原生质体；S5，将酶解液和原生质体释放液的混合液过滤，离心分离，得到原生质体。提取与现有技术相比，本发明的提取方法具有提取活率高，碎片率和结团率低的优点，为后续进行单细胞测序实验提供了充足的材料。

技术研发人员：李新平,李泽卿,刘梦佳
受保护的技术使用者：武汉爱基百客生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/11