一种以修饰二肽合成胸腺法的方法与流程

本发明涉及一种多肽药物合成领域，特别涉及一种以修饰二肽合成胸腺法新肽的方法。

背景技术：

1、中文名：胸腺法新

2、英文名：thymalfasin。

3、肽序列为：

4、ac-ser-asp-ala-ala-val-asp-thr-ser-ser-glu-ile-thr-thr-lys-asp-leu-lys-glu-lys-lys-glu-val-val-glu-glu-ala-glu-asn-oh

5、胸腺法新属于胸腺肽类药物，主要用于调节机体免疫功能。20世纪90年代，由sciclone us研发生产。1996年，获批在中国上市，商品名：日仙达。

6、胸腺法新可用于治疗慢性乙型肝炎并增强患者对病毒性疫苗的免疫应答，效果明显且副作用非常小，非常适合老年患者或者儿童使用，该品通过对辅助t细胞，细胞毒淋巴细胞及hk细胞等免疫细胞的增殖作用，间接性的杀死受病毒感染的肝细胞或者肿瘤细胞。

7、当前胸腺法新的合成方法主要有基因工程合成（如cn1431311等）和化学合成法（cn113321723a，cn112679600，cn106543279a等），其中基因工程合成法因工艺复杂，纯化困难，未能收到广泛使用。专利cn 102199205公开了一种使用peg树脂逐个氨基酸偶联的方法，但是该方法合成周期长，且peg的使用对困难序列的缓解效果有限，困难点偶联效率低，缺失肽严重；专利文献cn 104987382 公开了一种使用多个二肽片段取代序列中相邻的相同氨基酸，此方法在一定程度上降低了部分氨基酸的缺失，但是并没有从根本上解决胸腺法新肽困难序列问题；专利文献cn 108314725 和专利文献cn 108314725 分别公开了两种胸腺法新的片段合成方法，前者使用三个片段，后者使用四个片段，这种片段合成法可以解决部门困难点和片段脱落问题，但是合成难度增加，原料用量增加，且仍不能避免偶联效率低，缺失严重的问题。

技术实现思路

1、为解决现有合成过程中所存在的偶联效率低，缺失严重，成本昂贵，操作步骤繁琐，废液过量，不利于工业化生产的问题，本发明提供一种优化的胸腺法新的合成方法，此方法有效干扰了β折叠的形成，极大提升了原困难序列的偶联效率。

2、本发明的目的是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种以修饰二肽合成胸腺法的方法，其特点是，其步骤如下：

3、(1)合成主链保护二肽fmoc-asp-(dmb)leu-oh，fmoc-val-(dmb)val-oh，

4、fmoc-asp-thr（psi（me，me）pro）-oh；

5、（2）采用修饰二肽进行胸腺法新的固相合成，其中肽续的第6-7位氨基酸-asp-thr-，以fmoc-asp-thr（psi（me，me）pro）-oh的形式接入；第15-16位氨基酸-asp-leu-以fmoc-asp-(dmb)leu-oh的形式接入，第22-23位氨基酸-val-val-以fmoc-val-（dmb）val-oh的形式接入，按顺序依次固相合成胸腺法新序列的其他位点氨基酸（以merrifield经典spps从碳端到氮端依次按照顺序偶联剩余氨基酸），合成全保护胸腺法新，经裂解沉淀，得到胸腺法新。

6、本发明所述的一种以修饰二肽合成胸腺法的方法，其进一步优选的技术方案是，合成各个氨基酸所用的缩合剂为dic/hobt，hbtu/hobt/diea，pybop/hobt/diea其中的一种或多种。

7、本发明所述的一种以修饰二肽合成胸腺法的方法，其进一步优选的技术方案是，所用的反应溶剂为dcm、dmf、nmp、dmso中的一种或多种组合。

8、本发明所述的一种以修饰二肽合成胸腺法的方法，其进一步优选的技术方案是，所使用的fmoc脱除试剂为v/v20%哌啶/dmf溶液。

9、本发明所述的一种以修饰二肽合成胸腺法的方法，其进一步优选的技术方案是，采用的裂解试剂为：tfa:edt:h2o=90:7:3。

10、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

11、本发明胸腺法新的制备方法采用了特殊的保护氨基酸：fmoc-asp-thr(psi(me,me)pro)-oh，fmoc-asp(otbu)-(dmb)leu-oh和fmoc-val-(dmb)val-oh合成胸腺法新。肽续的第6-7位氨基酸（-asp-thr-），以fmoc-asp-thr（psi（me，me）pro）-oh的形式接入；第15-16位氨基酸（-asp-leu-）以fmoc-asp-(dmb)leu-oh的形式接入，第22-23位氨基酸（-val-val-）以fmoc-val-（dmb）val-oh的形式接入。本发明通过约每六个氨基酸残基插入一个修饰二肽打断β折叠，该方法有效地干扰了β折叠的形成，极大提升了原困难序列的偶联效率，防止困难肽续，明显减少缺失肽的形成，通过两个主链保护防止了环亚酰胺的形成，提高了粗肽纯度，极大降低了物料成本和纯化成本，利于进行工业化放大生产。

技术特征：

1.一种以修饰二肽合成胸腺法的方法，其特征在于，其步骤如下：

2.根据权利要求1所述的一种以修饰二肽合成胸腺法的方法，其特征在于，合成各个氨基酸所用的缩合剂为dic/hobt，hbtu/hobt/diea，pybop/hobt/diea其中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的一种以修饰二肽合成胸腺法的方法，其特征在于，所用的反应溶剂为dcm、dmf、nmp、dmso中的一种或多种组合。

4.根据权利要求1所述的一种以修饰二肽合成胸腺法的方法，其特征在于，所使用的fmoc脱除试剂为v/v20%哌啶/dmf溶液。

5.根据权利要求1所述的一种以修饰二肽合成胸腺法的方法，其特征在于，采用的裂解试剂为：tfa:edt:h2o=90:7:3。

技术总结
本发明是一种以修饰二肽合成胸腺法的方法。采用修饰二肽进行胸腺法新的固相合成，其中肽续的第6‑7位氨基酸以Fmoc‑Asp‑Thr（Psi（Me，Me）Pro）‑OH的形式接入；第15‑16位氨基酸以Fmoc‑Asp‑(Dmb)Leu‑OH的形式接入，第22‑23位氨基酸以Fmoc‑Val‑（Dmb）Val‑OH的形式接入，固相合成全保护胸腺法新肽，经裂解沉淀，得到胸腺法新粗肽。本发明方法通过约每六个氨基酸残基插入一个修饰二肽打断β折叠，防止困难肽续；同时，通过两个主链保护防止了环亚酰胺的形成，提高了粗肽纯度和收率，极大降低了物料成本和纯化成本，利于进行工业化放大生产。

技术研发人员：王帅军,周奕,蒋昌威
受保护的技术使用者：江苏诺泰澳赛诺生物制药股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13