一种分析颗粒细胞基因表达的方法与流程

本发明涉及生物技术和分子生物学，尤其涉及一种分析颗粒细胞基因表达的方法。

背景技术：

1、原始卵泡由一层扁平的卵泡细胞和一个未分化卵母细胞组成，它的启动生长分为2个阶段。首先，卵泡细胞由扁平变为立方形，开始增殖，同时伴随卵泡抑素表达。随后，形成由单层立方形的颗粒细胞和卵母细胞组成的初级卵泡。初级卵泡的细胞迅速分化增殖形成次级卵泡，此期的颗粒细胞增殖为2～3层。到三级卵泡时，颗粒细胞分化为多层并出现空腔。此后，颗粒细胞分化为两类细胞，即围绕卵泡壁的壁颗粒细胞和围绕卵母细胞的卵丘细胞。排卵后的卵泡细胞迅速转化成黄体细胞。黄体化的颗粒细胞形成大黄体细胞，而黄体化的内膜细胞转化成小黄体细胞。

2、在卵泡发生的起始阶段，卵泡细胞还没有形成功能型促性腺激素的受体，所以卵泡生长启动是促性腺激素非依赖性的。颗粒细胞和卵母细胞之间的相互作用可能是卵泡启动生长的原因。卵泡启动生长之后，卵母细胞和颗粒细胞分泌的因子以及来自血浆中的因子对调节卵泡的发育分化起重要作用。卵母细胞分泌的因子指导颗粒细胞的生长分化，调控卵泡发育。卵泡生长启动的具体信号分子机制目前仍不清楚，干细胞因子对此可能起重要作用。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供了一种分析颗粒细胞基因表达的方法，通过细胞裂解、逆转录以及pcr扩增等流程制备基因表达文库，利用定量pcr对文库进行质控，纳米孔测序方法检测基因表达。

2、本发明的第一个目的是提供一种分析颗粒细胞基因表达的方法，包括以下步骤：

3、s1、分离颗粒细胞并裂解；

4、s2、逆转录颗粒细胞mrna为cdna；

5、s3、pcr扩增cdna得到文库；

6、s4、检测文库中的基因表达；

7、其中，逆转录引物与pcr扩增引物为同源序列。

8、进一步地，当体系中的颗粒细胞为单个时，可直接检测基因表达；当体系中的颗粒细胞为多个时，在pcr扩增cdna后、检测基因表达前，还包括对扩增产物进行文库接头标记的步骤。

9、进一步地，所述文库接头标记为向pcr扩增产物中加入标签序列，所述标签序列长度10-30bp，gc含量30％～70％。

10、进一步地，文库接头标记的核苷酸序列为seq id no.4-27。

11、进一步地，基因表达检测方法包括荧光定量pcr、高通量测序(ngs)与单分子测序等。检测方法优选单分子测序，更优选地，检测方法为pacbio公司单分子实时测序(smrt)方法或oxford nanopore technologies公司纳米孔测序方法。

12、进一步地，在步骤s4中，进行基因表达检测时，可采用用于文库质量控制的寡核苷酸引物，所述寡核苷酸引物扩增基因为gapdh、hprt1、b2m、actb、rps18中的一个或多个。

13、进一步地，所述寡核苷酸引物的核苷酸序列为seq id no.28-37。

14、进一步地，在步骤s2中，逆转录引物的核苷酸序列为seq id no.1-2。具体地，

15、seq id no.1：cccgactgctgcgatggaccgtgcac(t)30vn，

16、seq id no.2：cccgactgctgcgatggaccgtgcacgcrgrgrg。

17、进一步地，在步骤s3中，pcr扩增引物的核苷酸序列为seq id no.3。

18、进一步地，在步骤s1中，逆转录反应使用mmlv逆转录酶。优选地，逆转录酶为takara公司primerscript、roche公司transcriptor、thermofisher公司superscript等。

19、借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

20、(1)本发明最低可对单个颗粒细胞进行基因表达分析，节约珍贵、稀有样本量。

21、(2)本发明利用标签序列同时标记多个细胞，提高检测通量，降低分析成本。

22、(3)本发明采用定量pcr分析少量基因表达控制文库质量，可提高检测成功率。

23、上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。

技术特征：

1.一种分析颗粒细胞基因表达的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：当体系中的颗粒细胞为多个时，在pcr扩增cdna后、检测基因表达前，还包括对扩增产物进行文库接头标记的步骤。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述文库接头标记为向pcr扩增产物中加入标签序列，所述标签序列长度10-30bp，gc含量30％～70％。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：文库接头标记的核苷酸序列为seq idno.4-27。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：基因表达检测方法为荧光定量pcr、高通量测序或单分子测序。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在步骤s4中，采用寡核苷酸引物进行基因表达检测；所述寡核苷酸引物扩增基因为gapdh、hprt1、b2m、actb、rps18中的一个或多个。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述寡核苷酸引物的核苷酸序列为seq idno.28-37。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在步骤s2中，逆转录引物的核苷酸序列为seq id no.1-2。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在步骤s3中，pcr扩增引物的核苷酸序列为seq id no.3。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在步骤s1中，逆转录反应使用mmlv逆转录酶。

技术总结
本发明公开了一种分析颗粒细胞基因表达的方法，涉及基因检测技术领域。本发明通过细胞裂解、逆转录以及PCR扩增等流程制备基因表达文库，利用定量PCR对文库进行质控，纳米孔测序方法检测基因表达。其中，逆转录引物对应序列SEQ ID NO.1‑2，PCR扩增引物对应序列SEQ ID NO.3，定量PCR质控的目标基因为GAPDH、HPRT1、B2M、ACTB、RPS18中的一个或多个，对应引物序列SEQ ID NO.28‑37，文库接头对应序列SEQ IDNO.4‑27。本发明提供的检测方法兼容单个颗粒细胞或多个颗粒细胞。

技术研发人员：罗俊峰,李仁强
受保护的技术使用者：阅尔基因技术（苏州）有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13